Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 59
Текст из файла (страница 59)
Нельзя иасасывать раствор в пипетку ртом.) Тиобврбитуровая кислота: готовят 0,3</з-ный раствор в дистиллированной воде, рН 2. Методика Лиофилизованный полисахарид, содержащий от 0,01 до 0,25 мкмолей КДО, растворяют в 0,1 мл 0,02 н. Нз504 и инкубируют при 100'С в течение 20 мнн для выделения КДО из полимера. Образцы гидролизата разбавляют 0,2 н. Нз304 до 0,2 мл. Добавляют 0,25 мл периодатного реактива, перемешивают и оставляют на 20 мнн при комнатной температуре.
Добавляют 0,5 мл 0,2 н. раствора арсенита натрия. Инкубируют 2 мин при комнатной температуре и добавляют 2 мл 0,3%-ной тнобарбитуровой кислоты, рН 2. Перемешивают и инкубируют при 100'С в течение 20 мин. Охлаждают и определяют оптическую плотность при 548 нм. Величина оптической плотности 1 мкмоля КДО, измеренная в 1-см кювете, равна 19,0. Применение методики Описанная выше процедура применима для определения КДО в очищенных липополисахаридах или препаратах клеточной стенки. !г. химическнн сОстАВ 17.2.10.
Гептозы Продукт, выделяющийся при нагревании гептозы с серной кислотой, реагирует с цистеингидрохлоридом, образуя вещество с интенсивной оранжевой окраской. Это вещество превращается в соединение розоного цвета имеющее максимум оптической плотности прн 505 нм 1131. Реактивы Раствор серной кислоты: 6 частей концентрированной НтоО, доанвлнют к 1 части воды.
(Предостережение! См. рнвд. 17.2 2.) Раствор цистеингндрохлоридв: 0,3 г цистеингидрохлоридв рвствориют в 10 мл дистиллированной воды. Методика Пробы объемом 0,5 мл помещают в ледяную баню. Добавляют по 2,25 мл раствора серной кислоты. Пробирки с пробами встряхивают 3 мин в ледяной бане. Переносят в водяную баню с температурой 20еС на 3 мин, а затем нагревают в кипящей воде в течение 10 мин.
Охлаждают, добавляют по 0,05 мл раствора цистеингндрохлорида и хорошо перемешивают. Через 2 ч после добавления цистеингидрохлорида определяют оптическую плотность при 505 и 545 нм. Для настройки прибора на нуль при каждой длине волны используют контрольную пробу, содержащую все указанные реактивы, кроме цистеннгидрохлорида. Результат определяют по разности величин оптической плотности при 545 и 505 нм. 1 мкмоль Ь-глицеро-1)- манногептозы в 1 мл при ширине кюветы 1 см имеет оптическую плотность 1,07.
Применение методики Для обнаружения дезоксигексоз и дезоксипентоз можно применять методику, описанную Дише !7]. Приведенная здесь модифицированная методика Осборна 1131 представляет собой довольно специфический способ определения гептоз в очищенных препаратах гликопротеинов н липополисахаридов. 307 члсть !ч.метхволнзм 17.3. ЛИПИДЫ Липиды — это химически разнообразная группа биологических веществ, нерастворимых в воде, но растворяющихся в органических растворителях и содержащих обычно длинные углеводородные цепи.
Это определение относится к углеводородам с длинными цепями, спиртам, альдегидам, жирным кислотам и их производным, включая глицериды, фосфолипиды, гликолипиды и сульфолипиды. К липидам часто относят стерины, жирнокнслотные эфиры стеринов, витамины А, Г1, Б и К, каротиноиды и другие полинзопреноиды, поскольку они связаны с мембранами и могут экстрагироваться теми же растворителями, что и другие липиды. Обзор типов и строения лнпидов бактериальной клетки сделал О'Лнрп Р11 Липиды содержатся в плазматических мембранах всех живых клеток.
Вактериальные мембраны устроены гораздо проще, чем мембраны эукариотических клеток. Однако известно, что бактерии содержат, кроме фосфолипидов, очень много разнообразных липидов. К ним относятся сфипголипиды, нейтральные липиды, гликолипиды и множество необычных липидов, присутствующих, например, у бактерий таких родов, как СогупебасГепит, 1тогагЖа и Мусобас1гг!ит 1211. Считалось, что прокариоты не содержат стеринов.
Однако недавно было показано, что в бактериях присутствует сквален и множество различных стеринов 122, 281. Грамотрицательные бактерии содержат в наружной мембране уникальные липиды в липополисахаридных комплексах 1211. В цитоплазме некоторых бактерий накапливается в больших количествах поли-р-гидроксимасляная кислота, служащая источником углерода и энергии. Ввиду сложности состава бактериальных лнпндов описание способов суммарного анализа каждого их класса здесь невозможно. Варианты приведенных ниже методик, а также сложные способы более полного анализа бактериальных липидов можно найти в специальных статьях на эту тему 119, 20]. гл химнческии состав 17.3.1.
Неочищенные суммарные липиды По сравнению с другими методиками способ экстракции суммарных неочищенных липидов, описанный Блаем и Дайером 123], занимает меньше времени и требует меньшего числа процедур. Эта методика широко используется в работе с бактериями.
Клетки смешивают с хлороформом и метанолом, взятыми в количествах, при которых образуется монофазный раствор после смешивания с внутриклеточной водой [241. При разбавлении суспензии клеток водой или хлороформом образуется двухфазный слой. Липиды остаются в хлороформ~ой фазе, а нелипидные вещества — в метанольно-водной. Отделив хлороформный слой, можно выделить и очистить липиды, как описано ниже. Выход суммарных неочищенных липидов после отделения от нелипидных примесей должен быть выше 95о)о. Хара и Радин 1251 описали другую методику, не требующую применения хлороформа.
Ее преимущество заключается в том, что в отличие от метода Блая и Дайера она позволяет заменить стадию фильтрования центрнфугированием. Для экстракции липидов используется смесь гексана и изопропанола, а вещества нелипидной природы удаляются промыванием экстракта водным раствором сульфата натрия. Экстракт липидов можно фракционировать на колонках с силикагелем, используя гексан, изопропанол и водные смеси. Реактивы и материалы Абсолютный метанол и хлороформ.
применяют чистые свежеперегнанные реактивы 1х. чя апа1упса! Егабе). 1Предостережениет Хлороформ оказывает вредное действие на печень н является анастевирующнм средством. Во избежание контакта с жидкостью или парами следует работать в вытяжном шкафу. Метанол очень легко. воспламеняется и ядовит при попадании через рот.) Фильтровальная бумага %Ьа)шап № 1. Фарфоровая воронка Бюхнера диаметром 43 мм. Колба Бюхнера на гйб мл, Методика Густую пасту из 5 г влажных клеток или 1 г лнофилизованных клеток и 4 мл дистиллированной воды смешивают с 5 мл хлороформа и 10 мл метанола в про- часть зм мвтлволизм бирке со стеклянной пробкой. Смесь встряхивают в течение 5 мин и оставляют при комнатной температуре на 3 — 4 ч, периодически встряхивая.
Добавляют еще 5 мл хлороформа и 5 мл дистиллированной воды и встряхивают смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. Экстракт быстро фильтруют через фильтровальную бумагу %1!а(тап № 1 под слабым вакуумом. Фильтрат переносят в стеклянный мерный цилиндр для разделения слоев. Метанольно-водный слой полностью удаляют отсасыванием. Остаток клеточного материала вновь экстрагируют 5 мл хлороформа, фильтруют через бумагу %)за1- гпап № 1 и промывают фильтр 12,5 мл хлороформа. чРнльтраты объединяют и добавляют к слою хлороформа, отделенного при первой экстракции.
Экстракты хлороформа помешают в доведенный до постоянного веса стеклянный или фарфоровый сосуд и выпаривают досуха под струей азота в водяной бане при 35 — 40'С для получения сухого неочищенного суммарного препарата липидов. Все операции проводят в вытяжном шкафу. Количество неочищенных суммарных лнпидов определяют с помощью аналитических весов. 17.3.2. Очищенные суммарные липнды 134~ Реактивы и лгатериалы Растворители: дважды перегнаниый хлороформ (200 частей) и метанол (100 частей) смешивают с водой (73 частей).
Энергично встряхивают в разделительной воронке и оставляют для разделения на верхнюю (растворитель 1) н нижнюю (растворитель П) фазы. Каждую фазу сливают отдельно н хранят при комнатной температуре. (Предостережение( См. равд. 17.3.1.) Сефадекс 0-23 мелкогранулированный (Рьагшас(а Р!пе Сьелнса!з, 1пс., Рыса1аттау, )Ч. У.). Хроматографическая колонка размером 1Х!3 см с дном из пористого стекла и тефлоновым краном. Методика Принципы гель-фильтрации см. в равд.
16.3.7. 25 г сефадекса 0-25 замачивают на ночь в 100 мл растворителя 1. Растворитель над набухшими гранулами декантируют и промывают им же гранулы 4 раза. 3!О 1х химическин сОстАВ Готовят густую суспензию из гранул в растворителе 1 (общий объем 50 мл) и дегазнруют ее, поместив в сосуд под вакуумом на 10 — 15 мин. Суспензию изредка помешивают. Затем ее переливают в колонку, содержащую несколько миллилитров растворителя 1.
Продолжают добавлять суспензию до получения слоя сефадекса высотой 10 см. Создают давление 6,8 10' — 13,6 10' Па с помощью азота в баллоне для уплотнения слоя гранул сефадекса, на который затем помещают диск из стекловолокна. Колонку промывают 10 мл растворителя 1 и 10 мл растворителя П. Растворяют 150 — 200 мг высушенной неочищенной фракции суммарных липидов в 2 — 5 мл растворителя П. Фильтруют полученный раствор через воронку с фильтром из пористого стекла прямо в колонку с сефадексом. Воронку промывают 2 мл растворителя П. Подают на колонку азот под давлением 13 — 20.10' Па, так чтобы скорость протекающего раствора была 0,5 — 1,0 мл/ /мин.
Подключают к колонке растворитель П и собирают фракцию объемом 25 мл, прошедшую через колонку. Элюат концентрируют при пониженном давлении и комнатной температуре до получения мутной водной эмульсии. Эмульсию лиофилизуют. Высушенные липиды растворяют в смеси хлороформа и метанола (2;1, по объему), переносят в сосуды с известным весом и выпаривают растворители в токе азота при 35 — 40'С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
