Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 53
Текст из файла (страница 53)
1,5 частей свелгепрвготовлеиного раствора В (1,5 г персульфата аммония на 100 мл). 0,045 частен ТЕАТЭД. Молекулярная масса нуклеиновых кислот Значение )т (электрофоретической подвижности) для рибонуклеиновой кислоты с низкой молекулярной массой 176) и рибосомной рибонуклеиновой кислоты 1751 обратно пропорционально коэффициенту седиментацин. Следовательно, логарифм молекулярной массы обратно пропорционален величине электрофоретической подвижности 1781. Диапазон этой пропорциональности зависит от степени сшивки геля. Методы фракционирования низкомолекулярных олигодезоксирибонуклеотидов уже давно разработаны (?21, тогда как определение молекулярных масс высокомолекулярных дезокснрибонукленновых кислот пока еще не применяется в повседневной работе.
Микромвтод. Малые количества белков порядка нескольких микрограммов (1О-' г) или пикограммов (10 " г) можно разделять в заполненных гелем капиллярных трубках различных размеров с помощью электрофореза в неоднородной («прерывистой») системе. Этот метод в основном сходен с описанным выше макрометодом, но для его применения необходим прибор, м Физические методы приспособленный для проведения всех операций (заполнение трубок гелем, электрофоретическое разделение, извлечение гелей из трубок и их анализ) в малых масштабах. Преларативные методики. Описанный выше микро- метод нельзя превратить в столь же эффективную препаративную методику путем одного лишь увеличения размеров колонки. Чтобы увеличить количество разделяемого материала, можно использовать большое число трубок малых размеров, но в этом случае разделение становится трудоемкой и длительной процедурой.
При использовании для электрофореза больших колонок возникают проблемы, связанные с извлечением разделенных веществ из геля, с отводом выделяющегося тепла, с необходимостью удерживать слой геля в колонке и т. д. При конструировании приборов, выпускаемых промышленностью, делаются попытки так или иначе решить все эти проблемы. Кроме того, нужный компонент можно извлечь из геля, вырезав соответствующий участок геля и элюировав этот компонент путем диффузии нли с помощью электрофореза, Еше один способ извлечения разделенных веществ заключается в том, чтс им дают выйти из геля, после чего онн с непрерыв. ным потоком буфера поступают в коллектор фракций.
Приборы для препаративного электрофореза должны удовлетворять следующим требованиям. Необходимо, чтобы гель удерживался в колонке благодаря установлению гидростатического равновесия между верхним и нижним буферами; следует возможно более точно регулировать температуру с помощью циркулирующей системы охлаждения; важно, чтобы камера для элюирования имела небольшой объем. Описан целый ряд гелей и буферных систем, применяемых для препаративных целей [661. 16.5.2. Иммуноэлектрофорез ~65~ 16.5.3. Изоэлектрическое фокусирование[631 Изоэлектрическое фокусирование — это особый вид электрофореза, при котором происходит перемещение молекул через жидкостную колонку с постоянным гра- 275 ЧАСТЫЧ. МЕТАБОЛИЗМ диентом рН.
Лмфотерные молекулы, например молекулы белка, изменяют свой заряд по мере того, как пересекают градиент рН и попадают в зону, где значение рН равно нзоэлектрической точке (р1) данного белка. В этом положении молекула белка несет равное число отрицательных и положительных зарядов н поэтому больше не перемещается в электрическом поле. В этой зоне устанавливается равновесие между силами диффузии и электрофоретической подвижностью. Таким образом, при нзоэлектрическом фокусировании разделение основано на различиях в значениях р1 у разных белков. Для устранения конвекции колонку стабилизируют либо с помощью градиента плотности сахаровы, либо посредством сефадекса илн полнакриламида. Колонку заполняют специальным имеющимся в продаже материалом (амфолином), который представляет собой смесь амфолитов с различнымн значениями р1 в определенном диапазоне. В электрическом поле молекулы амфолитов располагаются в соответствии с их изоэлектрическими точками и образуют стабильный градиент рН с высокой проводимостью и большой буферной емкостью.
Введенная затем в колонку смесь белков распределяется по зонам, значения рН которых соответствуют нзоэлектрнческим точкам разделенных компонентов смеси. В продаже имеются амфолины с широкими и узкими диапазонами рН. Изоэлектрическое фокусирование применяется как в препаративном, так и в аналитическом вариантах. Для аналитических целей используют методики, очень сходные с диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, при этом полиакриламид с низкой степенью сшивки служит в качестве антиконвекционной среды.
Для препаративного разделения можно использовать готовое оборудование нли изготовить его самим. Аналитические методики Описаны четыре системы для изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле 1661. Система Кастимпуласа [691 рассматривается в следующем разделе. Трубку заполняют гелеобразующнм раствором н подвергают его фотополимеризации, как при диск-элект- 276 эв. еизичвскив методы рофорезе.
Образец можно включить в состав полимеризующейся системы, соответственно уменьшив объем добавляемой воды. Согласно другой методике, в трубку вносят слой амфолина (2,5е/о в 5о/о-ном растворе сахаровы) и проводят электрофорез в течение 30 мин для установления градиента. Затем образец в 10%-нем растворе сахарозы осторожно наслаивают на поверхность. геля под амфолнном. В трубку размерами 5тг,'65 мм вносят от 30 до 300 мкг белка. Электрофокусирование проводят при постоянном напряжении 150 В и силе тока, снижаюгцейся от 5 до 0,5 мА. Гели извлекают и окрагнивают одним из принятых способов, Например, по методике Грзсслина и др. [731, гели окрашивают при осторожном перемешивании в течение 30 — 60 мин в 0,2о/о-ном растворе кумасси яркого синего О-250 в смеси этанол — вода — ледяная уксусная кислота (45:50:5, объем/объем).
Для обесцвечивания гелей их обрабатывают тремя порциями смеси этанол— вода — ледяная уксусная кислота (40: 55: 5) в течение 2 ч. Чтобы измерить образовавшийся в геле градиент рН, столбик геля перед окрашиванием разрезают в продольном направлении. Полученные срезы разрезают на части в поперечном направлении. Каждый срез выдерживают в течение 1 ч в минимальном количестве воды, например в 0,5 мл или еще меньшем объеме, а затем в экстрактах определяют рН с помон(ью стеклянного микроэлектрода. При разделении белков с очень большой молекулярной массой эффект молекулярного сита можно уменьшить, если использовать смесь 0,5% -ная агароза — 2е/оный полиакриламид [791. В нижний электродный буфер добавляют раствор метилового красного (0,5 части на 1 млн.).
Раствор окрашивается в желтый цвет при переходе в более шелочную область геля. Гель для иэоэлекгринеского фокусирования (бу). 4,5 части волы. 2 части раствора А (25 г акриламида и 1 г БИС на 100 мл воды). 0,5 частей раствора Б (1,0 мл ТЕМЭЛ на 100 мл воды). 2,5 частен растаора В (4 мг рибофланина на 100 мл воды) 0,5 час~ей 40ь/ь-ного раствора амфолина 277 ЧАСТЬ 1Г. МЕТАБОЛИЗМ Верхний (анодный) электродный буфер представляет собой 5Б/д-ный раствор фосфорной кислоты, а нижний (катодный) — 5%-ный раствор этилендиамина. 16.5.4. Двумерное разделение Хорошо известно, что при разделении белков с помощью диск-электрофореза в одной полосе не всегда содержится только один белок, т.
е. разделение сложных смесей может быть неполным. Наиболее эффективный подход предусматривает две стратегии разделения: на основе различий в размерах молекул и в значениях р!. Например, образец можно вначале подвергнуть изоэлектрическому фокусированию в полиакриламидном геле. Затем гель извлекают из трубки или (если электро,форез проводился на пластине) вырезают узкую полоску геля. Эту полоску помещают у верхнего края новой пластины геля в том месте, где обычно делают канавки для образцов, и закрепляют ее растопленным агаром.
Проводят второй этап разделения — гель-электрофорез в присутствии ДСН, после чего гель окрашивают. Пример особенно эффективного разделения белков этим методом описан О'Фарреллом (77), которому удалось обнаружить 1000 белков в экстракте клеток Езс)1сг1СЫа соБ.
16.5. МАНОМЕТРИЯ Манометрическое измерение обмена газов между биологическими системами и окружающей средой в прошлом было основным средством изучения метаболизма. Во многих случаях манометрия и сейчас имеет преимущество перед другими методами, а иногда это единственно возможный способ исследования. Однако из-за сложности всей системы, связанной с манометрическими измерениями, а также благодаря появлению новых методов, таких, как определение концентрации ионов с помощью ионселективных электродов или газо- жидкостная хроматография, манометрия настолько утратила свою популярность, что ей угрожает полное забвение.
Конечно, трудно наладить настоящее «преподавание» манометрии в современных лабораториях при постоянной нехватке времени. Поэтому исследователю 278 и. оизнчаские методы приходится осваивать этот метод непосредственно в ходе проведения эксперимента. Поскольку манометрические методы позволяют осуществлять прямую и непрерывную регистрацию выделения или поглощения различных газов, таких, как кислород, водород, СОя, метан, а также ионы водорода, они находят широкое применение при исследовании гомогенатов тканей, клеточных и бактериальных суспензий и препаратов ферментов. Этот список можно дополнить косвенными методами, к которым относится, например, определение киназ на основе образования ионов водорода. Основным источником информации в этой области и прекрасным руководством по многим аспектам метаболизма может служить книга Умбрейта и соавторов «Мапоше(г)с Тесйп(с)пез» (821.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
