Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 65
Текст из файла (страница 65)
Важным условием для точного определения содержания в них нуклеиновых кислот является полная экстракция нуклеиновых кислот из клеток. 17.5.1. Определение ДИК по реакции с дифениламином Из всех колориметрических способов определения и идентификации ДНК в сложных смесях чаще всего используют реакцию этого полимера с днфениламином в смеси уксусной и серной кислот. Химизм этой реакции и природа образующегося окрашенного соединения еще не ясны. Преимущество описываемого ниже метода Бертона 1611 заключается в его чувствительности и в том, что точному определению ДНК мишает лишь очень небольшое число веществ.
Другой подобный метод описан в разд, 22.4.3. 334 !т. Хммицескии сОстАВ Реактивы, материалы и оборудование Хлорная кислота: 0 5, 1,0 и 2,5 и. растворы, (Предостережение! В нагретом состоянии (150'С) при контакте с окисляющнмися веще. ствами хлорная кислота может воспламеняться нли взрываться. Необходимо избегать попадания хлорной кислоты на кожу, в глаза и па одежду н работать с ней в вытяжном шкафу.) Дифеинламиновый реактив: 1,5 г очищенного днфениламина, пе.
рекристаллизованного иэ кипищего гексаиа (белые кристаллы, Т, = =52,9'С), растворяют в 100 мл перегнанной уксусной кислоты и добавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты (ч. д, ал геаиеп! дгаде), В день использования к каждым 20 мл дифениламинового реагеита добавляют по 0,1 мл водного раствора ацетальдегида с концентрацией 16 мг/мл (1 мл ацетальдегпда в 50 мл воды). (Предупреждение! Ацетальдегид очень летуч и токсичен.
Необходимо рабо. тать с ним в вытяжном шкафу.) Цитратно-солевой раствор (ЦСР): 0,15 и. )ЧаС!+0,015 н. растнор тринатрневой соли лимонной кислоты, рН 7,0. Стандартные растноры: имеющуюся в продаже кристаллическую ДНК растворяют в 5 10 — з М ХаОН до концентрации 0,4 мг/мл. Стандартные растворы готовят каждые две недели. Сначала смешивают объем основного раствора ДНК с равным объемом 1 н. хлорной кислоты и смесь нагревают при 70'С в течение 15 мин, а затем из этого раствора делают разведения 0,5 и, хлорной кислотой.
Вольшинство препаратов ДНК содержит но крайней мере !5% воды, поэтому при подготовке стандартных растворов трудно получить нлн приготовить совершенно безводную ДНК. Следует помнить о возможных неточностях, вознякающнх из-за использования таких препаратов ДНК в качестве стандарта. Другим способом приготовления стандартов является гидролиз ДНК и определение содержания фосфата в 1 мг ДНК [62). Результаты выражают в микрограммах (или миллиграммах) фосфора ДНК, а не самой ДНК. Удобным стандартом является также дезоксирнбоэа, приготовленная в виде водного раствора (10 — з М).
Растворы можно хранить 3 мес в холодильнике. Приготовив разведения основного раствора ДНК 0,5 н. хлорной кислотой, можно построить калибровочную кривую для определения ДНК с дифеняламниом. При использовании таких стандартов результаты выражают в виде дезоксирибозных эквивалентов ДНК. Спектрофотометр или колориметр и стеклянные кюветы. Центрифуга, позволяющая работать прп 10 000 3. Центрифуга должна иметь охлаждающее устройство пли находиться в холодной комнате.
Цеитрифужные пробирки на 15 или 30 мл. Водяная баня с температурой 70'С и термастат пли водяная баня с температурой 30'С. Пробирки из пирексового стекла размером 15Х125 мм. 335 ЧАСТЬ ИА МЕТАБОЛИЗМ Методика Используют суспензию, приготовленную из 5 †мг (сухого веса) биомассы бактерий в 1 мл ( -5 10'е— 1 1О" клеток на 1 мл для бактерий, имеющих размер клеток Е. соД).
Если в культуре концентрация клеток недостаточна нли если в среде присутствуют вещества, мешающие определению, то клетки собирают центрифугированием. Комплексные среды содержат компоненты нуклеиновых кислот и сахара, которые удаляются при сборе и отмывании клеток центрифугированием. Для большинства бактерий клетки собирают центрифугированнем при 5000 д в течение 15 мин при 4 — 5'С. Осажденные клетки суспендируют в ЦСР в объеме, составляющем 'lю объема культуры. Клетки центрифугируют 15 мин при 5000 д и температуре 5'С и ресуспендируют в холодном ЦСР. Если клетки растут в солевой среде н концентрация их достаточна, культуру можно использовать для выделения ДИК непосредственно. Каждую пробу бактериальной культуры или суспензни бактерий в ЦСР подкисляют достаточным количеством 2,5 н.
хлорной кислоты до получения конечной концентрации перхлората 0,25 н. Подкисленную пробу охлаждают во льду в течение ЗО мин и центрифугируют 10 мин при 10000 и. Осадок, содержащий нуклеиновые кислоты, суспендируют в 0,5 мл 0,5 н. хлорной кислоты, помешивая стеклянной палочкой. Добавляют еще 3,5мл 0,5 н. хлорной кислоты и нагревают суспензию 15 мин при 70'С. Во время этой процедуры следует периодически помешивать или встряхивать суспензию. Подогретую суспензию центрифугируют 10 мии при комнатной температуре при 5000 и и осторожно сливают надосадочную фракцию в !О-мл градуированную пробирку.
Осадок вновь экстрагируют таким же образом. Объединяют оба экстракта, записывают их объемы и перемешивают. Для проведения реакции с дифениламином различные аликвоты объединенных экстрактов смешивают с достаточным количеством 0,5 и. хлорной кислоты до получения объема 2 мл. Целесообразно нз каждого экстракта готовить 10-кратные разведения (0,2 мл, 1,0 мл и 336 гх химнчвскни состав 2,0 мл), для того чтобы быть уверенным в том, что интенсивность окраски будет в пределах стандартной калибровочной кривой. Доводя объемы всех проб до 2,0 мл, добавляют в каждую пробирку по 4,0 мл дифепиламинового реактива и тщательно перемешивают.
Объем в пробирках с разведениями стандартных проб (от 5 до 100 мкг(мл) также доводят до 2,0 мл с помощью 0,5 и. хлорной кислоты и смешивают их содержимое с 4,0 мл дифениламинового реактива. Контрольную (слепую) пробу для спектрофотометра готовят, смешивая 4 мл дифениламинового реактива н 2,0 мл 0,5 н. хлорной кислоты, Пробирки инкубируют прн 30'С 16 — 20 ч (или в течение ночи).
Если раствор в пробирках мутный, его центрифугируют при 10000 и 15 мин для удаления негидролизовавшегося белка. Измеряют оптическую плотность надосадочной фракции при 600 нм, используя для сравнения контрольную пробу (разд. 16.1.1). Концентрацию ДНК в каждой пробирке определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов ДНК и концентрацией в них ДНК, дезокснрибозы нли фосфата. Тщательный контроль температуры не обязателен. Если все пробирки, в том числе пробирки со стандартными растворами, инкубируют при одинаковой температуре, ее значение не влияет на результаты.
Калибровочную кривую получают для каждой серии определений. 17.5.2. Определение РНК по реакции с орцином Реакция альдопентоз с подкисленным орцнном, в результате которой образуется зеленый хромофор, является классической реакцией в химии сахаров.
Эта реакция позволяет определять содержание рибозы в РНК, 20% общей окраски дает дезоксирибоза. С помощью этой реакции определяют РНК или рибонуклеотиды в растворе, а также в тканях илн клеточных экстрактах 1621. ЧАСТЬ 1У. МЕТАБОЛИЗМ Реактивы и оборудование Хлорнд железа(1П): !00 мг РеС!з.бНзО растворяют в 100 мл концентрированной НС! (ч. д. а., геайеп! Кгабе).
(Лредостережение( См. равд. 17.3.3.) Спиртовой раствор орцнна: 5,0 г орцнна растворяют в !00 мл этаяола. Хранят в темной склянке. Имеющийся в продаже орцнн обычно крпсталлнзуют нз бензола. Если получают желтые крнсталлы, необходима перекрпсталлнзацня. Орцнновый реактив: в день использования реактива смешивают равные объемы реактивов хлоряда железа(1П) н спиртового раствора орцнна. Окончательный раствор реактива должен быть ярко-желтого цвета.
Хлорная кислота я соляная кислота; 0,1 н. (Лредостереженпе1 См. равд. 17.5.!.) Стандартные растворы для анализа РНК. Раствор, содержащий 200 мкг/мл РНК нагревают с 0,25 н. хлорной кислотой прн 70'С в течение 30 мнн. Добавляют равный объем 0,1 н. НС! до конечной концептрацнн РНК 100 мкг/мл. Предвочтнтельным стандартом является адеяозян-5смонофосфат (АМР), поскольку его концентрацню можяо точно измерить.
Раствор АМР с концентрацией 200 мкг/мл нагревают в 0,25 и. хлорной кнслоте н добавляют к нему равный объем О,! и. НС!. В результате получают раствор АМР с концентрацией 100 мкг/мл. Спектрофотометр нлн колоряметр н стекляяяые кюветы плн пробирки. Водяная баня с температурой 90 'С. Пробирки нз ппрекоового стекла размером !8Х 125 мм. Стеклянные шарики диаметром около 20 мм. Методика Готовят гидролизаты из суспензий бактериальных клеток, обрабатывая их хлорной кислотой, как описано в методике по выделению ДНК (равд.
17.5.1). Гидро- лизаты клеток разбавляют 0,1 н. НС! так, чтобы оии содержали от 10 до 100 мкг РНК в 1 мл. !Гидролизаты клеток из 0,8 — 1 мг (сухого веса) биомассы содержат около 100 мкг РНК,1 Разбавленные гидролизаты и стандарты смешивают с двумя объемами орцинового реактива, закрывают пробирки стеклянными шариками и нагревают 30 мип при 90'С. Объемы проб зависят от типа спектрофотометра или колориметра. В болыпинстве случаев 1,0 мл экстрактов или стандартов смешивают с 2 мл орцинового реактива.
Пробирки охлаждают в струе водопроводной воды и измеряют оптическую плотность раствора в каждой из них прн 665 им. Копцентраци(о РНК или иуклеотидов определяют по калибровоч- !т. Химичвскнй состхя ной кривой, полученной для известных количеств АМР или РНК (равд. 16.1.1). Калибровочную кривую следует строить для каждого анализа или серии анализов. С помощью реакции с орцином можно достоверно измерить от 15 до 100 мкг РНК в экстракте бактериальных клеток. Применяя в качестве стандарта АМР, результаты выражают в виде пуринрибозидных эквивалентов РНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
