Главная » Просмотр файлов » Методы общей бактериологии (том 2)

Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 75

Файл №947293 Методы общей бактериологии (том 2) (Методы общей бактериологии в трех томах (ред. Герхардт)) 75 страницаМетоды общей бактериологии (том 2) (947293) страница 752013-09-15СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 75)

При таком объеме реакционной смеси пучок света должен быть очень узким. Для ежедневного определения большого количества проб реактивы объединяют, чтобы снизить число необходимых добавок. Реакцию начинают добавлением субстрата. Каждый опыт должен иметь контроль на; 1) суммарную скорость реакций, каталнзируемых г(АРН-оксидазой и аденозинтрифосфатазой, путем проведения реакций в отсутствие субстратов и 2) восстановление ХАЕН-связанного субстрата (если это возможно) путем проведения реакции в отсутствие АТР. Удобным вариантом этой методики является сильное снижение скорости окисления МАРН путем замены КАЭН на )ЧАВРН. Лактатдегидрогеназа реагирует с ИАРРН со скоростью, составляющей примерно 10% скорости реакции с 5)АПН.

Поскольку НАПРН-оксндазная активность в бактериальных экстрактах обычно очень низка, единственное, что нужно для устранения излишне высокой скорости окисления 5)АЭН, — это компенсаторное увеличение (приблпзптельно в 100 раз) содержания лактатдегндрогеназы. При сопряженном анализе с использованием лишь одного вспомогательного фермента обычно достаточно его добавления в постепенно увеличивающихся количествах до тех пор, пока не будет возможным точное определение линейной нача.'(ьной.

скопос7и основной пеакццн. методика определения времени, необходимого для достижения линейной Зчз 1в. ФвзмвнтАтивнля Активность скорости реакции, и количества каждого вспомогательного фермента, добавляемого в реакционную смесь, разработана и описана Мак-Клуром 129).

Оби1ие замечания Комиссия по ферментам Международного биохимического союза рекомендует во всех случаях считать единицей ферментативной актнвности количество микромолсй субстрата, потребляемого в 1 мнн (или продукта, образующегося в 1 мин). На практике, однако, активность ферментов часто выражают в других единицах, взятых из оригинальных статей, опубликованных в различных журналах. Поэтому и в описанных ниже методиках приводятся различные единицы активности (в том виде, в котором онн даются авторами).

Однако, где зто возможно, следует использовать активность ферментов в международных единицах. Необходимо еше раз предупредить читателя о том, что собранные здесь методики определения активности ферментов нельзя считать догмой. Каждая методика была разработана (в большинстве случаев) для определения конкретного фермента в данной бактерии (в частности, Е. со(1), поэтому не будет излишним подчеркнуть, что условия, необходимые для получения максимальной активности фермента у бактерии одного вида, не обязательно окажутся оптимальными для того же фермента у бактерии другого вида. Применение методик без учета конкретных особенностей бактерий может привести к ошибочным выводам.

18,2.2. Общие меры по стандартизации При определении удельной активности фермента в клетках необходимо учитывать ряд факторов. Прежде всего, следует использовать насыщаюшие концентрации субстратов. В этом случае возможно определение количества единиц ферментативной активности, присутствующих в данном препарате, при условии линейной зависимости активности как от времени реакции, так н от количества присутствующего фермента. Выполнение этого условия проверяют эмпирически для каждого.слу- 391 ЧАСТЬ 47.

МЕТАБОЛИЗМ чая, В описываемых ниже экспериментах наглядно демонстрируется, какие именно способы применяют обычно для этой цели, а также каковы различия между ферментативной и удельной ферментативной активностью. Для опытного сотрудника эта разница очевидна, но для начинающего студента она может стать источником значительных затруднений. В привсдениых ниже примерах с 8-галактозидазой в качестве источника ферментов использовали обработанные толуолом клетки Е. со(Е Методика определения удельной активности фермента и обработка клеток толуолом описаны в разд. 18.2.8.

Стандартизация определения 8-галантозидазы у Е. сой Используют любой дикий штамм Е. соП и выращивают две культуры по 100 мл (А и Б) при сильном встряхивании в течение ночи (37 'С). В обеих культурах индуцируют синтез р-галактозидазы внесением в культуральную среду 2,5 мМ изопропил+Р-тиогалактопиранозида в качестве индуктора, Синтез фермента культурой Б снижается при добавлении в среду 20 мМ глюкозы. Удобно пользоваться основной средой, содержащей в 1 л: 2 г КНзРОь 7 г КзНРО4, 1 г (4чН4)з504, 0,1г МцС14 6НзО и 2,5 г безвитамннного "ндролизата казеина.

Доводят рН среды до 7,2. В этих условиях синтез р-галактозидазы почти не подавляется. Культура А дает более чем достаточно клеток для последующих опытов. Клетки культуры Б в результате катаболитной репрессии глюкозой содержат значительно меньше 8-галактозндазы, чем клетки культуры А. Количество биомассы используемых клеток удобно определять по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью при 420 нм (определяемой с помощью калориметра) суспензии клеток в 0,05 М натрий-фосфатном буфере. рН 7,2, н сухим весом бактерий.

Культуры должны быть разбавлены соответствующим образом, так чтобы зависимость между оптической плотностью и сухим весом была ли. нейной (равд. 25.2.2). В описываемых ниже экспериментах в качестве относительной меры при измерении био- 399 иь Фнтментлтивнля активность массы можно использовать единицы оптической плотности при условии, что измерения проводятся при таких концентрациях клеток, когда зависимость между оптической плотностью и количеством биомассы имеет линейный характер. Клетки в культурах А и Б собирают центрифугированием, промывают один раз 0,05 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,2, и ресуспендируют в том же буфере.

Отбирают пробы и соответствующим образом разводят их, чтобы определить количество биомассы (например, по оптической плотности при 420 нм или в микрограммах сухнх клеток в 1 мл) в единице объема. Затем клетки обрабатывают толуолом, как описано ниже (равд. 18.2.8), после чего их можно использовать в последующих процедурах по стандартизации. Зависимость активности фермента от времени Готовят 10 — 20 проб реакционной смеси, содержащих достаточное количество клеток (обычно его определяют в предварительных опытах с различными концентрациями клеток). Реакцию начинают добавлением о-нитрофенил-0-ГЗ-галактопиранозида, а останавливают с помощью ХазСОм который вносят через О, 1, 2, 4, 6, 8, 1О, 15, 20, 25 и 30 мин. Снимают показания оптической плотности при А4ть н определяют время, в течение которого скорость реакции остается линейной.

Выбирают удобное для эксперимента время (например, 15 мин) в пределах линейного участка кривой и пользуются им в последующих экспериментах. Зависимость активности фермента от количества биомассы Готовят еще одну серию разведений реакционной смеси, содержание клеток в которых увеличивается от нуля до относнтельно высокого уровня. При повышенном содержании клеток дополнительную мутность суспензии при 420 нм следует учитывать путем сравнения с контрольными пробами. Контрольные пробы по составу идентичны опытным, но в них отсутствует о-ннтрофенил р-)л-галактопиранозид. Значения Ачзь контроль- 393 ЧАСТЬ !Ч.

МЕТАБОЛИЗМ ных проб вычитают из соответствующих значений опытных проб. Все реакции заканчивают в заранее определенное время (например, через 15 мин). Затем вычисляют активность фермента и откладывают ее значения в виде функции количества биомассы в реакционной смеси, как показано на рис. 18.1. Результаты, полученные при работе с данным Пбщаа боолагса — 3 ферментом, можно считать достоверными при условии, Рис. !8.1.

График зависимости что анализ проводился в фермеитативкой активности от пределах линейного участка количества биомассы. рассмотренной выше кривой. Эти же процедуры по стандартизации следует провести с клетками культуры Б. После расчета ферментативной активности, приходящейся на единицу биомассы (1 мг или 1 мкг сухого веса или одна единица оптической плотности при 420 нм), и сравнения полученных результатов с результатами для клеток культуры А определяют удельную актнвность фермента, присутствующего в каждой культуре. Клетки культуры Б, подвергавшиеся катаболитной репрессии, имеют более низкую по сравнению с клетками культуры А активность 8-галактозидазы на единицу биомассы. 18.2,3.

Общие методики Мы не можем описать здесь подробно все многочисленные способы определения различных ферментов. Достаточно сказать, что анализ может быть непрерывным, когда за реакцией наблюдают, не нарушая ее хода, или периодическим, т. е. связанным с периодическим отбором проб для измерения потребления субстрата или образования продукта. Например, фумаразу можно определять с помощью непрерывного анализа, применяя пря- !а. ФвимаитативнАЯ АктиВнОсть мое спектрофотометрическое измерение или метод сопряжения с другой ферментатнвной системой (анализ глутаминсинтетазы последним методом см.

в равд. 18.2.11). Предпочтительнее, однако, применять метод с периодическим отбором проб. Его осуществляют с помощью самых разнообразных способов, включая спектрофотометрический, манометрическнй, полярометрическнй и хроматографический. Проводят измерения также с помощью электродов и с использованием широкого набора химических агентов и изотопов (гл. 16).

Характеристики

Тип файла
DJVU-файл
Размер
4,16 Mb
Тип материала
Предмет
Учебное заведение
Неизвестно

Список файлов книги

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6559
Авторов
на СтудИзбе
298
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее