Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 89
Текст из файла (страница 89)
Эти два раствора можно было бы смешивать в различных пропорциях, получая растворы с различной осмоляльностью, но одинаковым показателем преломления. Приращение показателя преломления (а) для углеводов равно 0,00143; показатель преломления л раствора углевода можно вычислить по формуле л=л,+ОС, где л,— показатель преломления воды (1,33252 при 25'С), а С вЂ” концентрация углевода в граммах на 100 мл раствора.
Можно, конечно, определять показатели преломления растворов и с помощью рефрактометра. Использование плазмолизировапных клеток при изучении транспортных процессов подробно описали Мэлони и др. 131. Применение протопластов описано Абрамсом 17]. 19.3.3. Неметаболизируемые аналоги для раздельного изучения транспорта и метаболизма Во многих случаях при изучении транспорта желательно отделить собственно транспортный процесс от последующего метаболизма, особенно в тех случаях, когда нужно продемонстрировать концентрирующее поглощение. В отношении фосфотрансферазных систем полная диссоциация двух процессов невозможна.
Существуют три основных способа отделения транспорта от метаболизма; 1) с помощью неметаболизируемых, но транспортируемых аналогов; 2) путем использования мутантов с блокированным метаболизмом, но сохраненным 463 ЧАСТЫЧ. МЕТАБОЛИЗМ Таблица 1эд. Примеры неметаболнзнруемых аналогов, нспользуеммх для неученая транспорта у бактерий Источник данных Метаболнанруеыый субстрат Аналоги транспортом и 3) с помощью мембранных везнкул, не содержащих цитоплазматнческнх ферментов.
Список некоторых часто используемых аналогов приведен (с указанием соответствующих лнтературных источников) в табл. 19.1. 19.3.4. Мутанты с блокированным метаболизмом Отбор мутантов для изучения транспорта гистидина у Ба1топеПа уурпттигтпт подробно описан Эймсом [9).
Широко используются для этой цели мутанты гу+ Е. со- Й, лишенные 11-галактозидазы, но сохраняющие систему транспорта для р-галактозидов; эти мутантные штаммы можно получить в коллекциях генетически маркированных культур (разд. 13.10). 19.3.3. Мембранные везикулы Использование мембранных всзикул, предложенное Кабаком и Штадтманом [19), становится все более популярным. Обзор пх применения при изучении транспорта был сделан недавно Конингсом [23). Первый этап получения везикул обычно состоит в превращении изучаемых бактерий в осмотически чувствительные формы; последние подвергают лизису в условиях, при которых возможно образование везикул.
Сфе- !9. ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ТРАНСПОРТ ропласты грамотрицатсльпых бактерий, например Е. со- 1!, можно получить, обрабатывая клетки лизоцимом и ЭДТА 1181; при такой обработке внешняя мембрана клеточной стенки остается на сферопласте. Протопласты грамположительных бактерий часто можно полностью освободить от струнтур клеточной стенки путем обработки клеток муралитическим ферментом. Для Вас(1/ия а!еда/ег!иа!, Вас!1/ия яиа(!1!я, Игер1ососсия /аесаВя и М. 1уяог/е!йг!Сия использовали лизоцим, для Яар/ту1ососсия аигеия — лизостафин.
Кобаяси и др. 122) выделили везикулы из штамма АТСС'9790 В. /аесайя с помощью методики, которая достаточно иллюстративна. Они суспендировали клетки в осмотически стабилизирующем растворе, содержащем 500 мМ глицилглиции и 2 мМ Мд30! (рН 7,2), затем добавляли 0,5 мг лизоцима на 1 мл и инкубировали ! ч при 37'С (протопласты можно также стабилизировать сахарозой вместо глицилглицина). Суспензию прото- пластов центрифугировали, ресуспендировали в гипотоническом растворе, содержащем 50 мМ трис-малеат (рН 7,4), 250 ММ сахарозу, и 5 мМ М9$0м и обрабатывали дезоксирибонуклеазой 1, для активации которой требуются ионы магния.
Суспензию охлаждали, гомогенизировали с помощью гомогенизатора для тканей и центрифугировали 10 мин при 5000 д для осаждения мембран. Мембраны ресуспеидировали в трио-малеатпом буфере с сахарозой и М850м а затем пропускали через пресс Френча (700 кг/см9). Полученную суспензию дважды центрнфугировали: при 27000 я для удаления крупных частиц и при 48 000 8 в течение 90 мин для осаждення везикул. Возможны различные варианты этой методики, и для выбора оптимальной процедуры применительно к конкретному организму нужны предварительные опыты. Конингс и др. 1241 описали сокращенную одноэтапную методику для грамположительных бактерий, в особенности для В, яиа!!1!я.
Получаемые препараты обычно неоднородны по размерам везикул, а препарат Кабаяси и др. 1221 содержал как нормальные, так и вывернутые везикулы, что видно на электронных микрофотографиях при использовании метода замораживания — скалывания. Нз Е, соЛ часть гч. метаволизм можно получить препараты, содержащие только «нормальные» («иевывернутыс») везнкулы. Например, Кабак [18! описал методику, включающую осмотический лизис, без использования пресса Френча; при его использовании везнкулы Е.
со(( могут содержать в основном «вывернутые» формы, которые накапливают Саэь, вместо того чтобы экскретнровать его, и не способны поглощать такие вещества, как пролив [8). Непрерывность мембраны везнкул лучше всего можно проверить, определив степень набухания или сжатия последних при изменении осмоляльпости суспендирующей среды. Для этого можно использовать методы, описанные в предыдущем разделе (равд. !9.3.2), включая определение изменений светорассеяния.
Функциональное состояние везикул испытывают, определяя их способность к транспорту растворенных веществ, например пролина. 19.4. ЛИТЕРАТУРА 19.4.1. Общая литература 1. Атеэ С.-Р. (.. Тгло гпейодэ (ог йе аэаау о1 апппо асщ (гапэрог1, Ме1Лобэ Епгущо!., 32, 843 — 849 (1974). В статье подробно описываются методы измерения поглощения гистндина Ю.
!ура!тамит. Описаны методы, применимые к растущим, голодающим или нерастущим каеткам; они могут также применяться для изучения многих других систем транспорта у бактерий. 2. 5атаппа С., Ма1!ене М. Р., вуттегтап 5. Ваыс Ьас!ено1ойу, 4й ей ТЛе %!!!(агпз 5 %!1й!пэ Со., Вап!тоге, !973. Стандартный учебник, в котором рассмотрены вопросы осмоса н проницаемости с методической точки зреяия (разделы гл.
6). 3. Ма!опеу Р. С., 7(азййе! Е. )?., йглэоп Т Н. Ме1Ьодз 1ог з(пду!пй 1гапэрог1 1п Ьас(ег!а. Мейобэ МещЬгапе В!о1., 5, 1 — 49 (1975). Блестящий обзор основных методов изучения систем транспорта у бактерий; представлены данные по конкретным культурам, обсуждаются многие важные технические детали. В основном рассматривается транспорт лактозы, однако описанные методы пред. ставляют общий интерес 4. )говел В. Р. Вас1епа! 1гапэрог1, Магсе! (Зе(г!гег, 1пс., 14еэч уог1« 1978. Книга по вопросам транспорта; вступительная глава М. «рутаи посвящена методологии этой проблемы; многие последующие главы содержат описание методов определения. 57 Внеег 5., Ранасйагууа Р.
Са11опз, апныонсэ, апб тегпЬгапеэ, Ме(Лоде Епхущо1., 32, 881 — 893 (!9?4). 19. ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ТРАНСПОРТ В статье описаны методы определения поглощения катионов и приведена таблица изотопов, имеющих практическое значение. 6. Яаг(е!талл Е. У. Ена!напои о! УигдЫИу, р1азто!уь!я, апд дер)аято1уяи о! р)ап! сеиь, Ме!Лодь Се1! РЛуьто!., 2, 144 — 216 (1966).
Предметом статьи являются растительные клетки, но больвая часть представленного материала применима к бактериальным клеткам, которые также обы'шо имеют стенки. Особенно ценно описание плазмолиза н тургора. 19.4.2. Специальная литература 7, АЬгатя А. Л. В(о1. СЬет., 235, 1281 — 1285 (1960) . 8. Айелдог( К. Н., Бтаейе!т Е. А. Л, Вас!ет)о1., 117, 888 — 899 (1974).
9. Атея С.-Р. Е. Мерподз Епгуто1., 32, 849 — 856 (1974). 10. АглоМ ат. У., Гасу У. В. Л. Вас!егю1., !31, 564 — 571 (1977). 11. Солтау Е. У., УУоюляу М. ВтосЬет. Л., 47, 347 — 355 (1950). 12. Ватад!ал )!. У. СН1. Ееч, МктоЫо1., 2, 377 — 422 (1973). 13. Вийогя М., С!!!гя К. А„Нат!Нол У. К„Еяйегя Р. А., бытий Р. Апа!. Сйст., 28, 350 — 356 (1956). 14. Ерйет ат., Бсйи!Уг Б. С.
Л. Оеп. РЬуя!о1., 49, 221 — 224 (1965). 15. Нат(!гол ат. А. 1п: В. А. Наддосй апд В. А. Нагл!поп (ед.), МкгоЬ1а! епегаеисз, р. 185 — 216, СатЬТЫуе (Лп(четь!!у Ргезь, Л(етч Ъ'огй, 1977. 16. НагоМ Р. М., Айелдот) К Сшг. Тор. Метьг. Тгапяр., 5, 1 — 50 (1974). !7. Нигвиг С., Вгаил С. В., Реайоду )!. А., Л. Вас!ет!о!., 90, 1692— 1695 (1965).
18. Кайасй Н. У!. Мерподь Епгнто!., 22, 99 — 120 (1971) . 19. Кайасй Н. Я., 5(агйтал Е. )!. Ртос. Наи. Асад. !Л.З.А., 55, 920— 927 (1966). 20. Калоя К., Релд!ег У. Н. ВтосЫт. В1орйуя. Ас1а, 509, 289 — 299 (1978). 21. Керея А. Ситг. Тор. МетпЬг. Тгапьр., 1, 10! †!34 (1970). 22. КоЬауазй! Н., Уал Вгил! У., Наго!д Р.
М. Л. Вю!. СЬегп., 253, 2085 †20 (1978). 23. Кол(луя ат. М Адч. М(сгоЬ. РЬуь|о1., !5, 175 — 251 (1977). 24. Колтая ат. Н., В!яясйор А., Уеелйитя М., Уггтси!ел С. А Л. Вас(ег(о!., !16, 1456 — 1465 (!973). 25. Еетл В. С., Ргееяе Е. Л. Епщгоп. 591. НсаНЬ, Раг1 С, Епщгоп. Неа1!Ь Зс!., 13, 1 — 21 (1978). 26. АФасРола!д Е. Е., Оегйагд! Р. Сап. Л. МкгоЫо1., 4, 109 — 124 (1958). 27. Магдгг!я Я.
Е. АтсЛ. ВюсЬет В!орйуь., 118, 323 — 831 (1967]. 28. Матса!я Я. Е. НапдЬ. Ехр. РЛаггпасо!., ХХ/2, 166 — 192, 1970. 29. Мал!ига )7. Е., Оегйагд! Р., Л. Вю1. СЬет., 239, 3361 — 3371 (1964). 30. Майи Т. С., Киоте!гя С. У. В!осЬ!т. В!орйуь. Ас!а, 249, 583— 587 (1971). 31. Мисйе!! Р. Вю1. Вен., 41, 445 †5 (1966). 32.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
