Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 92
Текст из файла (страница 92)
11.2. В первом случае точность примерно соответствует линии я=20 на том же рисунке. 11.4. СВЕТОРАССЕЯНИЕ Методы, основанные на измерении светорассеяния, широко используются для изучения роста чистых культур. Они очень эффективны н часто бывают полезны, но иногда при их использовании можно получить ошибочные результаты. Основными преимуществами методов являются быстрота и то, что при их применении клетки сохраняются в интактном состоянии.
С помощью методов светорассеяния можно получить информацию о содержании макромолекул, что обычно не представляет первоочередного интереса для бактериолога, но с нх помощью нельзя определить число клеток. Физические н математические основы светорассеяния сложны, однако и при упрощенном рассмотрении этого явления можно получить ответы на большинство интересующих микробиолога вопросов. Метод основан на принципе Гюйгенса. Электромагнитное излучение взаимодействует с электронными зарядами в любом веществе.
Если энергия света не может быть поглощена, то квант света той же самой энергии (цвета) должен быть отражен. Этот свет распространяется во всех направлениях, т. е. все атомы в физическом теле служат вторичными источниками света. Те фотоны, которые движутся в исходном направлении, остаются в фазе, но те, которые движутся в других направлениях, с точки зрения наблюдателя, отличаются по фазе от световой волны, идущей непосредственно от источника света. В зависимости от расстояния и направления фотон, испускаемый атомом, отличается по фазе от фо- 11.
ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА тонов, испускаемых другими точками физического тела. Свет, проходящий через вещество, замедляется вследствие этих взаимодействий пропорционально показателю преломления. Описанные явления определяют закон отклонения и фокусировку света в больших телах, таких, как призма, линза, дождевая капля или оконное стекло. В последнем случае свет, рассеиваемый во всех направлениях, кроме прямого, взаимно компенсируется.
Остается идущий в исходном направлении пучок света, слегка замедленный относительно светового пучка, не проходящего через стекло. 1!.4.1. Турбидиметрия Бактериальиые суспензии состоят из частиц, размеры которых лежат в пределах между атомами — с одной стороны и стеклянными линзами — с другой. Основная часть рассеиваемого суспензией света направлена почти (но не полностью) в том же направлении, что и падающий пучок (рис. 11,3). Интенсивность света, рассеиваемого атомом или очень малой частицей, обратно пропорциональна длине волны падаю1цего света в четвертой степени. Поэтому мелкие частицы сильнее рассеива. ют голубой свет и лучше пропускают красный.
Именно по этой причине небо кажется голубым, а дым и многие вирусные суспензии — голубоватыми. В случае оконного стекла свет, идущий в любом направлении, кроме исход- Рис. 11.3. Светорассеяние случайно ориентированных бактерий. Показано угловое распределение света, рассеиваемого при прохождении пучка слева направо через суспензию клеток, которые по размерам н физическим свойствам сходны с Е. со1й выросшими в минимальной среде. Нижний пучок соответствует распределению света для сферических клеток, верхний — для зллипсоидных клеток с отношением осей 4: 1.
.х О о О и а 1О'ч ч Оо члсть п. Рост ного, взаимно компенсируется, и поэтому проходящий свет сохраняет свой исходный оттенок. В случае бактерий рассеянный свет примерно обратно пропорционален второй степени длины волны светового пучка исходного направления 128!. Если небо кажется голубым, а оконное стекло прозрачным, то бактериальная суспензия, подобно облаку, имеет промежуточный цвет н кажется белой, но не прозрачной. Поскольку оиа выглядит мутной, или непрозрачной, приборы используемые для измерения этого феномена, называют турбидиметрами (от лат.
«1цг(цбцз» вЂ” мутный) . В бактериологии для измерения мутности широко принято использовать любой колориметр или спектрофотометр. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, попадает на фотоэлемент (рис. 1!.4,А). Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. В идеальном фотометре пучок света должен быть очень узким, так чтобы фотоэлемента достигал свет, рассеиваемый только в прямом направлении, т. е. прибор должен иметь хорошо коллимированную оптику. Такой фотометр дает значительно большие величины поглощения, чем обычные приборы с плохо коллимированной оптикой, у которых значительная часть света, рассеиваемого суспензией, попадает на фотоумножитель (рис.
!1.4,Б). Поэтому их измерительная система реагирует таким образом, как будто света рассеивается меньше, чем в действительности. Чем больше бактерий на пути света, тем ниже интенсивность света, проходящего через пробу. При низком уровне мутности это явление описывается простой геометрической зависимостью, поскольку интенсивность не- рассеиваемого света убывает экспоненциально с увеличением числа бактерий. Геометрическую зависимость между мутностью суспензии бактерий и их количеством можно вывести, если рассмотреть суспензию, которая в 1О раз (по сравнению с исходной) снижает интенсивность проходящего света. Предположим, что имеются две одинаковые суспензии в двух кюветах, расположенных таким образом, что свет последовательно проходит через обе кюветы. На- и, изменении носта Рассеянный наппо6ленне обет паЖюшего пучка потна ознпьтр и!епь суспензня 5окжрнй Детектор Б Рассеянный обет лампа тольтр мель суспензня боктернй детектор Рис.
11.4. Схематическое изображение калориметра с фильтрами, А. Колориметр с узким пучком; практически весь отклоняющийся от прямого направлении рассеянный свет не попадает на фотодетектор. Б. Колориметр с широким пучком; часть отклоияюшегося от прямого направления рассеянного света попадает на фотодетектор, из-за чего снижается чувствительность измерений. сколько снизится интенсивность света после прохождения через две кюветы? Интенсивность света будет равна О,1 0,1, т. е. 0,01 интенсивности исходного пучка, В идеальном случае такое же соотношение будет справедливо для одной кюветы с удвоенной концентрацией бактерий. Математически эта закономерность формулируется так: интенсивность нерассенваемого света (!) равна интенсивности падающего света (1,), умноженной на 10 и'7™, где 1(у~о — концентрация суспензии, которая в 10 раз снижает интенсивность проходящего света: у=1, 10 — и71е~о.
Так, при (Р = (Р'ш ! =О,1!сн а прн удвоении концентрации бактерий 1=0.01!о. 477 часть и, Рост После логарифмирования обеих частей равенства имеем — !Я//1р=)ЯТр//= РР/ТР1р. Сходная зависимость (закон Ламберта — Бара; разд. 16.1.1) справедлива для поглощения света окрашеннымн пробами. Ее можно вывести аналогичным путем. Большинство приборов для определения мутности имеет шкалу, градуированную в 1д(7р//) !зта величина называется поглощением (адсорбцией, А) или оптической плотностью (ОР)).
Термин «оптическая плотность» раньше был распространен (его используют как для мутных, так и для светопоглощающих растворов), но мы будем пользоваться более новым термином — «поглощение». В идеальном случае в соответствии с вышеприведенным уравнением график зависимости величины А бактериальной культуры от числа клеток имеет вид прямой линии, проходящей через начало координат. Ее можно описать уравнением А=К %', где К вЂ” наклон (равный 1/%1р) и А=!д/р/1. Как показано на рис. 1!.5, истинное поглощение увеличивается меньше, чем предсказывает формула (см.
также разд. 16.1.1), так как свет, рассеивающийся от одной бактерии, попадает на другую и вновь рассеивается таким образом, что возвращается в фотоумножитель. Кроме того, в результате взаимодействия бактерий благодаря броуновскому движению они распределяются более равномерно и меньше рассеивают проходящий пучок света (подобно оконному стеклу). Приведенные рассуждения позволяют сделать некоторые практические выводы, касающиеся измерения мутности суспензнй. Теоретические !28, 29! и экспериментальные (20, 28, 30, 31! исследования свидетельствуют о том, что разбавленные суспензии большинства бактерий независимо от размера клеток характеризуются почти одинаковым поглощением на единицу сухого веса.
Однако в пересчете на частицу нли на колониеобразующую единицу величины поглощения зависят от размера клеток. Было предложено следующее приближенное правило: поглощение прямо пропорционально величине сухого ве- Н.ИЗМЕРЕНИЕ РОСТЛ О,б м ы И 0,4 =а 00 02 О/ са (28). Это правило приложимо к коккам и палочкам и является первым приближением более точного правила, которое гласит, что рассеяние первичного пучка света пропорционально среднему объему клеток в культуре в степени е/з. Объекты, которые мельче бактерий (например, вирусы), или бактерии, суспензия которых имеет голубоватый оттенок, плохо подчиняются этим правилам.
Более крупные объекты, например дрожжи, нитевидные бактерии и скопления бактерий, суспензии которых выглядят мутными и не обязательно окрашенными, тоже могут не подчиняться рассматриваемому правилу. Там же, где правило приложимо, константа пропорциональности, связывающая измеренное в любом хорошо коллимированном фотометре поглощение с величиной сухого веса, будет одинаковой для разных объектов. У хороших фотометров фотоумножитель находится на значительном расстоянии, и благодаря отличной коллимации детектор в них улавливает только узкий пучок света. Такими свойствами обладают модели 479 Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
