Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 87
Текст из файла (страница 87)
Кроме того, довольно легко регистрировать увеличение размеров мицелиальной колонии. Например, для измерения роста можно использовать очень длинную стеклянную трубку, содержащую слой питательного агара. После инокуляции на одном конце трубки мицелий начинает расти вдоль трубки, и если ее соединить еще с одной, то он может «перерасти» в следующую и т. д. [47] При этом колонии растут в одном измерении, тогда как на поверхности агара они растут в двух измерениях, а во встряхиваемых культурах — в трех.
Скорость увеличения размера колонии в одном, двух нли трех измерениях зависит от скорости удлинения концевых гиф, которые иногда растут перпендикулярно поверхности колонии, тогда как использование растущей массой мицелия питательных компонентов зависит от площади поверхности колонии. В случае встряхиваемой культуры на характер роста накладывает отпечаток природа и величина фрагментов инокулята; для крупных фрагментов рост ограничивается уже на ранней стадии за счет медленной диффузии питательных компонентов в мицелиальную массу.
Следовательно, основная сложность заключается в том, что мицелиальный тип роста, вероятно, отклоняется от экспоненциального и зависит от геометрии роста и природы инокулята. Во встряхиваемых культурах рост зависит от скорости встряхивания, которая влияет на склонность мицелия распадаться на более мелкие фрагменты. Клеточная дифференцировки Процесс превращения клеток энтеробактерий из крупных и богатых РНК форм в мелкие и бедные РНК клетки по достижении стационарной фазы характеризуется рядом свойств, присущих клеточной дифференцировке. Правда, в бактериологии существует много более четких примеров дифференцировки, например превращение палочек в кокки, вегетативных клеток бацилл в эндоспоры, а также образование микроорганизмами экзо- 448 И ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА спор, цист и почек.
При определенных обстоятельствах формирование нитевидных клеток можно также рассматривать как процесс дифференцировки. Рассмотренные выше изменения клеток и их возможная обратимость создают потенциальные причины ошибок при измерениях роста микроорганизмов. Адсорбция на поверхности Многие бактерии в результате адаптации или мутации могут приобретать высокое сродство к поверхностям, в частности к стеклу (эффект обрастания). Прикрепление микроорганизмов к стенкам сосуда явилось причиной неудач некоторых экспериментов с хемостатными культурами.
Именно поэтому при длительных контактах микроорганизмов со стенками сосудов для культивирования следует использовать пластмассу или тефлон 1311. Другие способы уменьшения способности клеток расти на стенках сосудов заключаются в использовании фторуглеродных покрытий или больших объемов культуры в крупных емкостях, а также интенсивного перемешивания и частых пересевав бактерий в новые стеклянные сосуды.
Кроме того, эффект обрастания может быть снижен в результате использования детергептов, силиконового покрытия стенок и сред с высокой ионной силой. В частности, с этой проблемой приходится сталкиваться при разведении культуры для измерений высоко- чувствительными методами, например для микроскопии или подсчета колоний в чашках.
Эта проблема обсуждается также в разделах, посвященных соответствующим методам (равд. 11.1.1, 11.2.1 и 25.1). Гетерогенное окружение Измерение роста микроорганизмов в естественных условиях связано с большими трудностями 191. Как правило, в природных условиях встречаются смешанные культуры, в которых бактерии прикрепляются друг к другу, к частичкам почвы и листьям. В этих случаях рост измеряют четырьмя основными методами, Первый из них заключается в определении фиксации '4С-двуокиси углерода растущей биомассой 1531. Второй предус- 449 ЧАСТЬ П. РОСТ матривает идентификацию клеток с реплицирующейся ДНК, меченной 'Н тимидином, по радиоавтографии [10], В третьем методе для идентификации микроорганизмов в образцах почвы применяют флуоресцирующие антитела [48]. Наконец, информацию о росте микроорганизмов можно получить с помощью усовершенствованной массспектрометрии газов, выделяемых образцами почвы [41].
Подробное обсуждение этих вопросов не входит в задачи настоящего руководства. Рост бактерий рассматривается также в гл. 10 и в работах [1 — 7]. 11.1. ПРЯМОЙ ПОДСЧЕТ 11.1.1. Подсчет в микроскопе Подсчет в микроскопе представляет собой широко распространенный быстрый и дешевый метод, оборудование для которого имеется в каждой бактериологической лаборатории, Однако его применение иногда может привести к ошибочным результатам. Возникающие при этом проблемы в значительной степени решены в работе Норриса и Поуэлла [42], но широкое использование подхода этих авторов ограничено требованием специальной техники и оборудования. Основная трудность прямого микроскопического подсчета связана с воспроизводимостью процесса заполнения камеры жидкостью [42]. В предлагаемом ниже методе толщину жидкости в камере измеряют с помощью хорошего микроскопа, фокусируя объектив на бактериях, находящихся на верхней и нижней поверхностях жидкости.
Расстояние между ними измеряют с помощью микрометрической шкалы микроскопа. Горизонтальные размеры между двумя отметками в имеющихся в продаже камерах довольно точны [42], и поэтому здесь не возникает проблем. Второй трудностью является адсорбция бактерий на поверхности стекла, в частности пипеток. Эту адсорбцию можно снизить, если для разведений вместо воды использовать раствор с высокой ионной силой. Другой способ заключается в использовании раствора формальдегида [нейтрализованного КзНРОА) со следами аиион- 11.
ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА ного детергента 1421. Преимуществом формальдегида является его способность подавлять рост и подвижность бактерий, а смеси КЗНР04 с детергентом — ее способность препятствовать агрегации. Однако детергент даже в очень низких концентрациях может лизировать некоторые микроорганизмы.
Адсорбцию клеток можно уменьшить, если использовать пластмассовые сосуды и пластмассовые наконечники пипеток. В описываемой ниже процедуре отбираемые пробы разводят 0,1 н. НС1. Пипеткой с пластмассовым наконечником их быстро переносят в стеклянную счетную камеру, где клетки прикрепляются к поверхностям камеры. Счетная камера Хауксли (А 70 Не!Ьег; Натчйз)еу, ).Ы., ).апс(пд, Епп1апд) лучше камеры Петрова-Хаузера (Аг(ЬНТ Н. ТЬошаз Со., РЬ11абе!рЬ(а, Ра.), поскольку ее оптическая толщина с обычным покровным стеклом достаточно мала, чтобы ее можно было просматривать с масляной иммерсией. Хотя большинство подсчетов проводят в безыммерсионных системах, иногда из-за большого числа клеток или из-за их способности образовывать скопления необходимо использовать масляную иммерсию.
Камера Хауксли представляет собой пластинку, имеющую круглую выемку глубиной 20 мкм, на днв которой нанесены метки, ограничивающие зону 50Х 50 мкм. Основным преимуществом микроскопического метода подсчета является возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта. Наблюдение с масляной иммерсией делает подсчет более утомительным, однако в этом случае лучше различаются индивидуальные клетки. Другие рекомендации можно найти в инструкциях фирм — изготовителей счетных камер, а также в лабораторных пособиях для микробиологов. Обсуждение методов разведения и статистической обработки результатов приведено в разд. 11.5 и в ряде работ [5, 461.
Методика 1. Камеру и покровное стекло промывают водой с небольшим количеством анионного детергента, а затем споласкивают водой и спиртом, промокают и сушат на воздухе. 451 ЧАСТЬ 1! РОСТ 2. Предварительно определяют концентрацию клеток. Если эта концентрация ниже 3 10' клеток в 1 мл, то приступают к следующему этапу, Если она выше, то предварительно разводят клеточную суспензию раствором Норриса — Пауэлла, приготовленным следующим образом. К 1 л воды добавляют 5 мл формалина (40%-ного формальдегида) и доводят рН (можно по индикаторной бумаге) до ?,2 — 7,4 с помощью твердого 5)азНРОЬ Количество добавляемого фосфата зависит от содержания в формалине муравьиной кислоты.
На кончике шпателя добавляют столько додецилсульфата натрия, сколько необходимо для прекращения быстрого лопания пузырьков, образующихся при продувании воздуха через раствор с помощью пастеровской пипетки. 3. К пробе добавляют равное количество 0,1 н. НС1. Это приводит к гибели бактерий и появлению на их поверхности положительного заряда, благодаря чему они перестают агрегировать, но начинают адсорбироваться на стекле. 4. Немедленно с помощью автоматической пипетки с пластмассовым наконечником (Р!ре((етап, Еррепдог(, Сеп1апг) в камеру Хауксли вносят около 5 мкл суспснзии, переворачивают камеру на 1 — 2 мин, затем возвращают ее в нормальное положение и оставляют на 3— 5 мин.
5. Рассматривают содержимое камеры в микроскоп, используя фазово-контрастный объектив (лучше с масляной иммерсией). Большинство клеток прикрепляется к нижней поверхности камеры, часть — к верхней, а остальные свободно движутся в камере (броуновское движение). 6. Фокусируют объектив на клетки, прикрепленные к дну камеры, и отмечают показания на микровинте (у хороших микроскопов шкала мнкровинта откалибрована в микрометрах).
Затем фокусируют объектив на клетки, прикрепленные к верхней поверхности камеры, снимают показания и прибавляют величину диаметра бактерий. Таким способом можно определить толщину камеры, которая обычно равна 20 мкм. В целях освоения метода тщательно измеряют толщину камеры в различных ее участках, чтобы убедиться в том, что она заполнена равномерно. 11 ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА 7. Подсчитывают число клеток в каждом малом квадрате. В оптимальном случае оно должно составлять 5 — 15.
Клетки, расположенные по краям квадрата, учитывают лишь в том случае, если они находятся на верхней или правой стороне. Для подсчета клеток внутри квадрата используют один регистр механического счетчика; второй регистр используют для подсчета количества квадратов. Некоторые исследователи пользуются счетчиком только для подсчета десятков, в уме подсчитывая однозначные числа. Для точного определения подсчитывают не менее 600 клеток, причем это необходимо делать при нескольких заполнениях камеры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
