Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 83
Текст из файла (страница 83)
Сами мембранные фильтры и аппарат для стерилизации фильтрованием должны стерилизоваться автоклавированием или каким-либо другим способом. Собирать бактериальныс клетки и готовить стерильные растворы путем фильтрования лучше всего под давлением азота. Такая фильтрация значительно снижает илн полностью препятствует окислению фильтруемого вещества благодаря положительному давлению инертного газа в фильтрующем устройстве. Если необходимо собирать клетки в стерильных условиях, то азот следует предварительно простерилизовать фильтрованием. Все консультации по вопросам рабочего давления и размера используемого оборудования следует получить у фирмы-изготовителя. Дополнительные сведения по осадочной и мембранной фильтрации можно найти в работах 147, 58, 601.
428 кк ЖИДкАя кУльтуРА 10.4.2. Центрифугирование Сбор бактериальных клеток путем центрифугирования обычно приводит к менее полному их отделению от культуральной среды, чем с помощью фильтрации. Однако этот метод позволяет получить культуральную среду и клетки, свободные от загрязнения посторонними веществами, например фильтрующим материалом; поэтому он широко используется для получения биомассы в лабораторных условиях. Но для приготовления стерильных растворов центрифугирование не пригодно.
Скорость осаждения клеток в процессе центрифугирования зависит от таких факторов, как вязкость среды, размер (диаметр) частиц и разница в плотности между клетками и суспендирующей средой. Все эти факторы определяют время и скорость центрифугирования в каждом конкретном случае. Для осаждения большинства бактерий из относительно невязких сред (таких, как питательный бульон) вполне достаточно центрифугирования при 1О 000 д в течение 10 — 15 мин.
Поскольку упаковка бактерий в осадке зависит от их размера и условий культивирования, при подборе скорости или времени центрифугирования необходимо руководствоваться тем, чтобы осадок при сливании надосадочной жидкости как можно меньше подвергался ресуспендированию. Оборудование для йентрифуеирования Лабораторные центрифуги работают как в периодическом, так и в проточном режиме, причем иногда оба вида операций можно выполнять в одной центрифуге. Существуют роторы самых разных типов, но все они работают по одному общему принципу — регулируемого приложения центробежной силы во вращающемся роторе.
Поскольку средний диаметр частиц в бактериальной культуре довольно мал, для разделения клеток и среды с помощью центрифугироваиия обычно необходимы высокис скорости вращения. При высокоскоростном центрифугировании образуется большое количество тепла, поэтому центрифуги должны быть оснащены собственной охлаждающей системой, Если такой системы нет, 429 ЧАСТЬ и. РОСТ то работу необходимо проводить в холодной комнате.
Кроме того, поскольку центрифужные роторы выпускаются различных размеров, при работе с ними следует исходить не из скорости и времени центрифугирования, а из величины центробежной силы (обычно выражаемой в единицах д) и времени центрифугирования. Фирмы— изготовители центрифуг — ОцРоп11пз1гцшеп(з, 1чап Яогча1, 1пс., 1п1егпайопа! Еоц1ргпеп1 Со., Весйпап 1пз1гпгпеп(з, 1пс. — публикуют табличные данные о скоростях вращения роторов и эквивалентных нм величинах центробежных сил.
При работе с большими объемами культуральной среды используют проточное центрифугирование (сепараторные центрифуги). Центрифуги с охлаждением фирмы ВцРоп1 — Зогча1 оборудованы специальным ротором и системой подачи среды для работы в проточном режиме. Этот метод пригоден для выделения большинства бактерий, кроме хлопьеобразующих видов и грибов, обычно забивающих пути подачи среды, Центрифуги типа 8(тагр1ез оборудованы длинными н узкими роторами, через которые культура подается снизу вверх. При высокой скорости вращения таких роторов клетки оседают на их стенках. Данный способ центрифугирования дает возможность очень быстро получать большие количества клеток, а также проводить дифференциальное центрифугирование частиц различного размера или плотности. Существуют модели цент рифуг как с ограниченной емкостью для биомассы, так и с непрерывным удалением осадка клеток.
Методика иентрифугирования Ниже описана методика центрифугирования, позволяющая получать отмыты" клетки в стерильных условиях. Если стерильность нс требуется, то метод можно упростить. 1. Прежде всего готовят соответствующее количество раствора для промывания клеток, получаемых после цснтрифугирования (равд. 25.1).
Объем раствора должен быть в 4 — б раз больше объема культуры, а значения ионной силы и рН промывающего раствора и росто- 430 !О. жидкАя культуРА вой среды должны быть очень близки. Перед использованием раствор стерилизуют и охлаждают до 0 — 4 С. 2. Используемый в работе центрифужный ротор охлаждают в холодильнике.
77редостережеиие: нельзя помещать ротор, имеющий комнатную температуру, на ось центрифуги, а затем охлаждать его с помощью центрифужной системы охлаждения. При этом ротор может сжаться и настолько плотно закрепиться на оси, что впоследствии возникнут сложности при его снятии. 3. Стерилизуют несколько центрифужных пробирок с крышками (полипропиленовые и поликарбонатные пробирки можно автоклавировать) и дают им остыть.
Для сохранения стерильности пробирки при ее последующем использовании перед автоклавированнем крышку и верхнюю часть пробирки обертывают алюминиевой фольгой. 4. Определяют объем центрифужных пробирок и с соблюдением правил асептики заполняют их на аз бактериальной культурой. Пробирки попарно уравновешивают. Если окажется непарная пробирка, ее уравновешивают с пробиркой, заполненной дистиллированной водой. Все пробирки надежно закрывают стерильными крышками.
5. Помещают попарно уравновешенные пробирки в ротор друг против друга. 6. Проводят центрифугирование в соответствующих условиях согласно инструкции фирмы-изготовителя. Большинство бактерий осаждаются при центрифугировании в течение 1Π— 15 мин при 10000п. Некоторые центрифужные системы имеют специальное приспособление, ограничивающее вибрацию ротора при его вращении с малыми скоростями (при остановке).
Если такое приспособление отсутствует, не исключена опасность взбалтывания осадка. 7, Пробирки вынимают осторожно из ротора и отмечают положение бактериального осадка. Надосадочную жидкость в стерильных условиях декантируют или переносят пипеткой в стерильный сосуд. При этом практически невозможно не вызвать частичного ресуспендирования бактериального осадка. Чтобы бактерии не попадали в сосуд, приходится оставлять часть надосадочной жидкости в пробирке. ЧАСТЬ 11. РОСТ о. Каждую пробирку с бактернальным осадком с соблюдением правил асептики заполняют на а/а объема стерильным холодным раствором для промывания.
Осадок бактерий суспендируют в этом растворе с помощью миксера типа Чог1ех. Этапы 4 — б повторяют не менее 4 раз, меняя раствор для промывания. 9, После завершения промывки надосадочную жидкость удаляют с соблюдением правил асептики и осадок суспендируют в небольшом количестве стерильной среды. Полученную суспензию используют в дальнейших исследованиях.
Число отмывок при фильтрации или центрифугировании зависит от условий культивирования, объема раствора для промывания и объема сырой биомассы. Если сырая биомасса занимает около 1/10 объема всей культуральной суспензии, то 4-кратной промывкой объемами раствора, равными исходному объему культуры, удаляется до 99,99о/о всех растворимых примесей. Несколько промывок нельзя заменить одной, объем которой равнялся бы суммарному объему всех промывок, поскольку каждая последующая промывка снижает уровень примесей почти в 10 раз.
10.5. РАСЧЕТЫ ВЫХОДА БИОМАССЫ При расчете выхода биомассы исходят из материального баланса устойчивой системы культивирования. Моно определил константу выхода, или экономический коэффициент (У), следующим образом; Образованные клеткн, г Иснользованный субстрат, г Выход биомассы в расчете на использованный субстрат часто обозначают как У„ло где в индексе указано отношение соответствующих концентраций. Широко принято использование соотношения масс для выражения выхода клеток на основании потребления углеродного субстрата [10, 421.
Выход можно довольно легко рассчитать, определив продукцию сухой биомассы за определенный период культивирования по отношению к массе использованного в этот же период углеродного субстрата. Если выход биомассы хотят отнести к потреблению 432 ю жидкая культура кислорода или образованию АТР, синтезируемого в процессе роста, то его определяют следующим образом: Сухой вес клеток, г Ооравованный АТР, моль ' Сухой вес клеток, г вшв Поглощенный кислород, моль При различных условиях и для многих микроорганизмов выход клеток, рассчитанный по отношению к образовавшемуся АТР или поглощенному кислороду, отличается постоянством.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
