Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 79
Текст из файла (страница 79)
Когда меняют сосуд, соединительное устройство освобождают от защитного материала; для надежности перед соединением со следукпцей стерильной линией более тонкую трубку следует об жечь на огне. Стерилизация среды Стандартные приемы стерилизации жидких сред описываются в гл. 23 этого руководства. Для предотвращения распада термолабильных компонентов среды используют стерилизацию фильтрованием. Небольшие объемы простых сред, используемых для культивирования бактерий, автоклавнруют непосредственно перед их использованием, но для автоклавирования больших объемов члсть ц.
Рост среды необходимо довольно длительное время. Так, в зависимости от состава среды сосуды, содержащие около 1О л жидкости, следует автоклавировать от ЗО до 90 мин прн !21'С. Для полной стерилизации 10-литровых объемов среды, содержащей такие компоненты, как кукурузная или соевая мука, требуется до 90 мин, тогда как среды, содержащие только растворимые компоненты, можно стерилизовать в течение ЗО мин при 121'С. Во время автоклавирования все сосуды следует соединить друг с другом для уравновешивания давления.
При автоклавировании больших объемов предварительно восстановленных сред для анаэробных бактерий необходимо особо тщательно установить, а затем и поддерживать химически восстановленное состояние этих сред. Сосуды, содержащие предварительно восстановленные среды, немедленно после автоклавирования подсоединяют к источнику с газом, не содержащим кислород. Как только в верхнем пространстве сосуда начинает конденсироваться пар, там создается частичный вакуум. Продувание газа без Оз позволяет ослабить вакуум, образованный во время охлаждения сосуда, и предотвратить попадание в среду кислорода из воздуха.
Запуск Непрерывному культивированию всегда предшествует непродолжительное периодическое культивирование, в процессе которого за счет избытка субстрата происходит накопление биомассы. Непрерывное культивирование следует начинать в тот момент, когда в периодическом режиме культура достигнет экспоненциальной фазы роста. При этом уменьшаются колебания, вызываемые подачей среды, и исключается непредусмотренное вымывание культуры, связанное с наличием лаг-фазы. Разбавление начинают со скоростью, меньшей, чем это требуется, и затем постепенно увеличивают ее до нужной величины.
Такой прием позволяет уменьшить колебания роста, вызываемые токсичными субстратамн, например фенолом. Реакция культуры в хемостате на токсичные субстраты более подробно обсуждается в работе Перта 141, 1к Жндкхя культуРА Отбор проб Лучше всего производить отбор проб культуры через специальный отвод в ферментере.
Иногда их отбирают также из выводной трубки ферментера, но это не рекомендуется делать при отборе малых объемов, поскольку на стенках выводной трубки могут находиться бактерии; при их попадании в пробу могут быть получены искаженные результаты. При отборе проб в процессе непрерывного культивирования необходимо следовать инструкции фирмы — изготовителя ферментера. Если пробы отбирают не из выводной трубки, а через специальный отвод, их объем должен составлять менее 10$ рабочего объема ферментера, так чтобы равновесие системы нарушалось не сильно. Трубку для отбора проб следует предварительно тщательно очищать. Некоторые ферментеры оборудованы воздушной системой очистки, которая обеспечивает сброс в ферментер содержимого трубки после отбора проб.
При использовании этой системы нет необходимости в ее предварительной очистке. 10.2.2. Турбидостат Турбндостат представляет собой самую простую нз всех хорошо перемешиваемых систем непрерывного культивирования 1611. Концентрация клеток в ней регулируется постоянной подстройкой определенной скорости поступления питательных компонентов. В отличие от случая хемостата концентрацию биомассы в турбидостате выбирает оператор, а скорость разбавления и соответственно концентрация субстратов поддерживается таким образом, чтобы сохранялся заданный уровень биомассы. Отсюда следует, что если нет необходимости в лимитирующих количествах субстрата, то он добавляется в избытке.
Поэтому работа системы (для используемой среды) наиболее стабильна при удельной скорости роста культуры, близкой к максимальной ища Пока концентрация всех компонентов среды избыточна, система работает в широких интервалах концентраций биомассы при скорости разбавления, близкой к критической. Именно в этих условиях хемостат наименее стаби- чхсты!, Рост лен. В отличие от того, что мы имеем в случае кемостата, скорость разбавления в турбидостате при тщательном регулировании биомассы всегда равна удельной скорости роста, независимо от того, находится система в состоянии равновесия или нет.
Наиболее уязвимым местом культивирования в турбидостате является точность регулирования биомассы. Большинство старых методов регулирования плотности популяции основано на оптическом измерении (в рассеянном или проходящем свете) с помощью фотоэлектрического датчика. Недостатком этих методов являются помехи, вызываемые пеной и пузырьками, которые образуются при аэрации, а также ростом клеток на стенках ферментера и, что более важно, на оптическом измерительном устройстве.
Если от помех, вызываемых пузырьками, можно избавиться, используя внешнюю проточную кювету, то пена создает серьезные проблемы. Зарастание бактериями оптических поверхностей можно частично преодолеть их протиранием, однако это малоэффективный прием. Возлагаются надежды на новые методы волоконной оптики, однако оии еще не апробированы.
Термин «турбидостат» относится к любому методу, при котором плотность клеток поддерживается на постоянном уровне, Он включает в себя методы, основанные на изменениях метаболизма, измеряемых с помощью «рН-стата» (481 и «СОмстата». Поскольку основные метаболические функции (такие, как поглощение бактери ями кислорода, выделение двуокиси углерода и в некоторых случаях изменение рН) тесно связаны со скоростью роста клеток и в конечном счете с удельной скоростью роста культуры, их можно использовать как показательные переменные при регулировке потока среды. Теоретически в качестве регулируемого параметра при культивировании в турбидостате может быть использован любой параметр, который поддается измерению. На практике же в этом качестве используют только те параметры, которые тесно связаны с ростом клеток.
Введение сложных комплексов фермеитер — ЭВп1 обеспечит более высокий уровень использования турби- ' достатиой теории, но эти комплексы требуют дальнейших разработок. 4ш !О. жидкАя культуРА 10.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ СИС"ГЕМЫ 10.3,1. Управляемая периодическая культура (рН) Управляемые периодические культуры нуждаются в специальных приборах, с помощью которых следят за параметрами среды и запуском подачи среды в ферментер таким образом, чтобы регулируемый параметр поддерживался на постоянном уровне.
Примером регулируемого параметра среды в ферментере служит величина рН, поддерживаемая на постоянном уровне путем автоматического добавления кислоты или щелочи. Основными компонентами системы контроля рН являются рН- электроды с защитным покрытием, рН-метр, блок автоматического титрования, сосуды с кислотой и щелочью вместе с гибкими шлангами, соединяющими их с ферментером, а также простой перистальтическнй насос или соленоидный клапан. Хотя можно использовать отдельно рН-электрод и электрод сравнения, чаще применяют стерилизуемый паром объединенный электрод, который занимает меньше места и в без того ограниченном объеме небольшого лабораторного ферментера.
Все компоненты системы ферментера, включая рН-электроды и электроды для определения растворенного кислорода, должны быть устойчивы к стерилизации паром или другими средствами, например парами окиси этилена или формальдегида. Особенно надежными считаются электроды фирмы 1пдо!й, которые могут быть автоклавированы многократно. рН-метр и блок автоматического титрования должны подходить друг к другу, поэтому их желательно покупать у одной и той же фирмы. Перистальтический насос надежно обеспечивает подачу кислоты или щелочи против довольно высокого отрицательного давления в ферментере, но при работе с лабораторными ферментерами вполне достаточно использовать простой соленоидный клапан (вентиль), регулирующий по принципу силы тяжести подачу в ферментер щелочи или кислоты.
Фирма Кайогпе1ег (Копенгаген, Дания) выпускает очень надежные системы для измерения рН и титрования, которые легко приспособить к ферментеру. Системы регу лирования рН этой фирмы и электроды фирмы 1пяо1д ЧАСТЬ П. РОСТ поставляются их лондонскими отделениями (ТЬе 1оп. доп Со.). Системы регулированиясодержания растворенного кислорода поставляются всеми основными фирмами, производящими ферментеры; эти системы позволяют контролировать скорость перемешивання среды и око. рость подачи кислорода. Особенно надежны электроды для измерения растворенного кислорода, поставляемые фирмой 1пз1гшпеп(аВоп 1аоога1ог1ез, 1пс., поскольку они без замены мембраны устойчивы к многократной стерилизации паром. Регулирование рН описано также в равд.
6.1 и 16.2,1. 10.3.2. Периодическая культура с добавлением субстрата (подпиткой) В периодической культуре переход от экспоненциальной фазы роста к стационарной может вызываться многими причинами, в том числе нехваткой важного питательного компонента или образованием токсичного метаболита. Если такой переход вызван нехваткой питательного компонента, то при добавлении свежей среды рост культуры будет продолжаться. Чтобы поддерживать экспоненциальный рост культуры с постоянной скоростью, скорость добавления среды и объем культуры в закрытой системе следует увеличивать экспоненциально.
Такой способ поддержания роста называют периодическим культивированием с подпиткой 119]. Способ с периодическим удалением культуральной среды, позволяющим добавлять свежую среду, называют длительным периодическим культивированием или отъемно-доливным культивированием. Непрерывное культивирование отличается от периодического, периодического с подпиткой и отъемно-долинного тем, что при нем скорость подачи среды и скорость удаления культуры одинаковы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
