Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 80
Текст из файла (страница 80)
Метод периодического культивирования с подпиткой можно использовать в случае потенциально токсичного субстрата, так как прн этом его концентрация в среде будет поддерживаться на низком уровне. Культивирование в периодическом режиме с подпиткой является средним между обычным периодическим культивированием и непрерывным культивированием. Иногда при периодическом культивировании с подпиткой происходит более 412 КЬ ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА значительное увеличение биомассы или выхода продукта, чем при обычном периодическом или непрерывном культивировании. Культивирование в лабораторных условиях по типу периодической культуры с подпиткой легко осуществляется простым добавлением в ферментер самотеком первичных или вторичных субстратов. Настоящее периодическое культивирование с подпиткой требует, чтобы объем жидкой среды в ферментере увеличивался.
Это требование обусловливает верхний предел времени культивирования, определяемый скоростью подпитки, а также изменение условий аэрации и эффективности перемешивания. Кроме того, при этом не исключена возможность обратного заражения свежей среды в сборнике из ферментера; поэтому желательно использовать прерыватель подачи среды (рис.
10.5). Одним из преимуществ периодического культивирования с подпиткой и длительного периодического культивирования является возможность регулирования скоростей роста. Этот аспект изучен еще недостаточно [41, хотя он может стать ключевым при разработке улучшения процессов промышленного культивирования, например для биосинтеза антибиотиков. 10.3.3.
Синхронная периодическая культура Биохимические процессы, связанные с определенными этапами цикла развития индивидуальных клеток, можно изучать в синхронизированной периодической культуре. Синхронизация культуры наступает в том случае, когда все клетки начинают делиться с почти одинаковой скоростью. При этом зависимость логарифма числа клеток от длительности культивирования приобретает ступенчатый характер в отличие от линейного при обычном росте в периодическом режиме культивирования. Несмотря па то что развитие синхронизованной культуры происходит довольно равномерно, сохранить синхронность в течение длительного времени трудно, поскольку требуется точный контроль.
Синхронизация культуры может быть достигнута путем периодического изменения критических факторов среды, К числу технических приемов, вызывающих синхронизацию деления клеток, относятся подавление, уско- 413 ЧАСТЬ и. РОСТ рение или задержка их метаболических функций циклическим способом. Популяция постепенно синхронизирует свой ответ на периодические колебания метаболической активности, а затем и показатели роста. Однако этот метод требует значительных отклонений от нормального метаболизма, поэтому его использование ограничено.
Единственным исключением является прорастание бактериальных спор как показатель начинающейся синхронизации культуры. Ступенчатые илн резкие изменения состава среды могут привести к прорастанию спор н тем самым смоделировать процессы, близкие к естественным. Однако для получения гомогенной популяции (достичь 100%-ного образования спор или их прорастания практически невозможно) требуется применение некоторых физических способов предварительной селекции. Общепринятый метод синхронизации культур основан на физическом выделении гомогенной фракции из гетерогенной популяции.
Такой подход, часто называемый синхронизацией путем селекции, позволяет избежать проблем, связанных с нарушением метаболизма. Согласно данным Кубитчека [341 и Пула (49$, в процессе клеточного цикла объем клеток Е. сой возрастает линейно и количество биомассы — экспоненцнально. Тот факт, что после деления клетки имеют наименьший объем, наталкивает на предположение, что с помощью центрифугирования (особенно в градиенте плотности) можно получить популяцию новых дочерних клеток из асинхронной культуры.
Данные о линейном увеличении объема клеток на фоне экспоненциального роста их массы свидетельствуют о том, что те клетки, которые готовы к делению, нли те, которые уже разделились, имеют самую высокую плотность, несмотря на различия в нх размерах. С помощью центрифугирования в градиенте плотности можно получить несколько фракций клеток, причем фракция с наибольшей плотностью будет содержать и молодые (дочерние), и зрелые (готовые к делению) клетки, а фракция с наименьшей плавучей плотностью будет содержать гомогенную популяцию клеток, которые находятся в одинаковой стадии роста. При сннхроннзацин пугем селекции в результате центрнфугировання в градиенте плотности нет возможности получить новые дочерние клетки для непосредственного нь жидкля культкРА изучения физиологии их роста, поскольку во фракциях, содержащих эти клетки, всегда присутствуют зрелые клетки, готовые к делению.
Однако с помощью центрифугирования в градиенте плотности можно получить инокулят для роста синхронизованной культуры. Затем путем прямого отбора проб из нее можно изучать физиологию бактерий, связанную с их клеточным циклом. Ниже описан главный метод получения синхронизованных культур, в основе которого лежит метод Митчисона и Винсента [431. Этот метод можно использовать в качестве начального этапа синхронного культивирования, имеющего свои характерные особенности в случае каждого изучаемого микроорганизма (371.
Метод синхронизации путем селекции К экспериментам по синхронизации приступают только тогда, когда определены основные условия периодического культивирования, в том числе кннетика асинхронной культуры. После этого устанавливают режим периодического культивирования таким образом, чтобы в течение экспоненциального роста клеточная масса удваивалась от двух до пяти раз. 1. Готовят 500 мл стерильной среды в нескольких колбах (например, в 250-миллилитровых колбах Эрлен- мейера). Инокулируют половину этих колб и инкубируют в соответствующих условиях, а остальные стерильные колбы хранят в тех же условиях.
2. Выращивают клетки в системе периодического культивирования до середины экспоиенциальной фазы. Быстро охлаждают культуру до 0 — 4'С, погружая колбы в ледяную баню. Клетки собирают 10-минутным центрифугированием на холоду при !О 000 и. 3. Осадок клеток ресуспендируют в 2 мл соответствующего ледяного буфера (папример, 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,0), используя гомогенизатор типа Чог1ех. Если клетки склонны к агрегации, то для получения суспензии отдельных клеток используют мягкую обработку их ультразвуком или мягкую гомогенизацию (в гомогенизаторе или размельчителе тканей). Для культур, которые особенно плохо поддаются ресуспендированию, можно вначале добавить к буферу 0,010/0 (вес/ чАсть и. Рост /объем) твина 80, а затем ! применить ультразвуковую или механическую обработку. 4.
Быстро, но осторожно наносят суспендированпые клетки на стерильный охлажденный градиент плотности фнкола. В зависимости от вида клеток градиент плотности готовят также нз сахарозы, коллоидного силиказоля или других веществ. В случае градиента сахаровы ее стерильный ох- ВМ а лажденный раствор наслаивают в увеличивающихся рис. 10.в. типпчиая кривая сии- коипентрациях в простерихроиизоваииой популяции Сап. лизованные и охлажденные терий.
до 0'С центрифужные пробирки. Например, вносят в стерильную центрнфужную пробирку 10 мл 35о/о-ной (вес/объем) сахарозы в фосфатном буфере, а затем на этот слой последовательно наслаивают по 10 мл раствора сахарозы разной концентрации (26,5; 25,5; 24,5; 22,0; 19,0 и 15,0а/а), приготовленного на том же буфере. Все буферные растворы готовят из основного 35",о-ного раствора сахаровы. Растворы сахарозы перед использованием следует стерилизовать фильтрованием, хранить на холоду и подвергать предварительной аэрации (в случае азробных бактерий). 5. Закрытые крышками центрифужные пробирки с клетками аккуратно помещают в охлажденную центрифугу и центрнфугируют 15 — 20 мин прн 2500 и на холоду (О'С). Для более точного разделения клеток подбирают скорость и время центрифугирования таким образом, чтобы видимая полоса бактерий передвигалась не более чем на з/з длины пробирки, И время, н скорость центрифугировання зависят от культуры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
