Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 78
Текст из файла (страница 78)
Допускается, что общий выход биомассы зависит только от лимитирующего питательного компонента, но не от удельной скорости роста культуры. Исключения нз этого допущения обсуждаются в разд. 10.5. Уравнения (10.8) н (10.12) пригодны для описания равновесия при непрерывном культивировании. Прежде чем с помощью концентрации биомассы и субстратов, а также удельной скорости роста определить условия культивирования, полезно рассмотреть удельную скорость роста как функцию концентрации субстрата. Многим ситуациям удовлетворяет уравнение (10.5). Подставив в уравнение (10.5) уравнение (!0.8), получим: '= к". (10.18) ~8+ !О жидкля кулътугл После преобразования уравнение (! 0.13) выглядит следующим образом: !з — о (10.14) с Подставив уравнение (10.!4) в уравнение (10.12), получим; )х/в(~о р р ) (10.15) Уравнение (10.15) связывает концентрацию биомассы с коэффициентом разбавления в условиях равновесия.
На рис. 10.3 представлена обобщенная реакция системы на скорость разбавления, предсказываемая уравнениями (10.14) и (10.15). Модель Моно !уравнение (10.5)1 — одна из нескольких моделей, описывающих зависимость скорости роста от концентрапии субстрата. Допущения, принимаемые в ней, упрощают ситуацию, однако они приемлемы далеко не для всех систем. Фундаментальная теория проточного культивирования детально обсуждается в работах !2, 32, 561. Оборудование Большинство из описанного выше оборудования для периодического культивирования микроорганизмов с перемешиванием среды можно использовать непосредственно для непрерывного культивирования.
Иногда для непрерывного удаления культуральной среды необходимо модифицировать ферментер. Так, для непрерывного культивирования требуется система двойного насоса (для добавления свежей среды и для удаления культу- ральной жидкости), используемая вместе с регулятором уровня среды; при этом культуральная жидкость удаляется через отверстие для отбора проб.
Такие насосы н регуляторы уровня среды поставляют многие фирмы, производящие ферментеры (Мел Вгппзц !ск Вс!епВВс Со., Тпе у!РТ!з Со., апд С!зегпарес !пс.). Двойной насос и система регулирования уровня среды, используемые для внесения среды н удаления культуры, обладают рядом преимуществ прн проточном 40! ЧАСТЬ П.
РОСТ культивировании в ферментерах больших емкобымосм отей, однако в малых ферментер ах удаление переливающейся через Уббабббб ! край культуральной среды происходит просто под действием силы тяжести. Специальные культиваторы с боковым отводом ! для удаления жидкости можно изготовить из стандартных стеклянных нли стальных сосудов. Особое внимание следует гэб д = - уделять поверхностному перемешиванию на уровне отверстия для отбора проб. Хорошее поверхноРнс. 10.3. Влияние нэмснсннй стное перемешивание по- скорости раэбавлсння на харак- лучают, если трубку для тернстнкн культуры в хсмостат. отбора жидкости [21] «ой снстсмс ппотонно~о культя или турбиннук! лопасть внровання, где прн вымывании культуры скорость разбавления псмЕп!ают на УРовне ОтпРиближаетсЯ к !бм., верстия для отбора проб под углом 5' к поверхно сти.
Стеклянные сосуды, из которых жидкость удаляется под действием силы тяжести, производит фирма Ве1- 1со 61азз, 1пс. !номер каталога 1970). Эти сосуды подходят для культивирования литровых объемов сред с небольшой плотностью бактерий. Компании, перечисленные в табл. 10.2, производят более универсальные сосуды для непрерывного культивирования, в которых обеспечивается перемешивание и аэрация даже очень плотных бактериальных культур. Однако эти сосуды необходимо дополнительно оборудовать для удаления культуральной жидкости. Определение скорости потока среды Тщательное регулирование скорости поступления среды в ферментер и выхода из него при постоянстве обье- КЬ ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА ма абсолютно необходимо для установления равновесных условий роста культуры. При проточном культивировании в хемостате скорость поступления свежей среды в ферментер определяет плотность культуры и удельную скорость ее роста.
Скорость поступления среды в процессе ферментацни следует тщательно отрегулировать и периодически проверять. На рис. 10А изображено простое устройство для измерения скорости поступления среды. Прокалиброванную пипетку (или бюретку) заполняют измеряемым объемом жидкости из резервуара, закрутив зажим Б; затем до начала измерений зажим А также закручивают.
Для определения скорости поступления жидкости зажим А откручивают и одновременно зажим В закручивают. Измеряют время, необходимое для удаления измеренного объема жидкости из пипетки. Для возобновления нормальной работы системы откручивают зажим В и закручивают зажим А. Скорость разбавления (илн удельная скорость роста в одном культуральном сосуде без рециклизации среды) можно высчитать, разделив скорость поступления среды на объем жидкости в ферментере.
Лредогвраи(ение заражения свежей средь! в резервуаре (сборнике) В результате аэрации н перемешивания проточной культуры образуется аэрозоль, содержащий большое число культивируемых микроорганизмов. Поэтому соединительный канал, через который поступает в ферментер свежая среда, может подвергнуться заражению.
Отсюда возникает необходимость оснащения этого канала специальным «прерывателем», который действует по типу асептического затвора между ферментером и резервуаром со свежей средой. Рис. 10.5 иллюстрирует основной принцип такого прерывателя 1211. Его нижняя часть обеспечивает медленную, но постоянную подачу стерильного воздуха, предотвращая тем самым аэрозольное заражение канала, через который поступает среда.
Верхняя камера устройства обеспечивает дополнительное прерывание потока поступающей жидкости. Этот прерыватель может быть использован как для периодического культивирования с добавлением субстрата, так и для непрерывного культивирования. 403 ЧАСТЬ и. РОСТ Подача сдай. доча ооороаоносо '" боэдута среды к насосу зажим В Важны В Рис.
10.4. 0.4. Прибор для определения скорости подачи среды. Рис. 1О.б. П и о р б р для предотвращения заражения среды в сборнике при непрерывном нли периодическом( с подпиткой) культивировании. Сборники и приемники !епрерывное культивирование требует довольно больших объемов среды и приводит к образованию соответствующих больших объемов культуральной жидкости с конечным продуктом. В табл. 10А представлены объемы свежей среды, необходимые для 20-часового непрерывного культивирования при различных скоростях разбавления. Для удобства там же приведено соответствующее время удвоения биомассьь Чтобы иметь возможность варьировать скорость подачи среды в случае сового культивирования, рекомендуется готовить достаточное количество среды.
Поскольку в большинств л ораторпых операций стерилизацию проводят путем е автоклавирования, предпочтительнее готовить требуемые объемы среды в бутылях соответствующего размера. 404 !О. жидкАя культурА Таблица 10.4. Количество среды, необходимое для непрерывного культивирования прн различных скоростях разбавления' Соответствующее время удвоения биомассы Отношение объема сРеды к объему Фермеитера, необходимое для 20 часового непрерывного культи вироваиия, мл!мл Скорость раз бавлеии» Ь 2,77 1,39 0,92 0,69 0,46 0,35 0,17 0,09 0,25 0,50 0,75 1,00 1,50 2,00 4,00 8,00 15 30 45 60 90 120 240 480 55,4 27,8 18,4 13,8 9,2 7,0 3,4 1,8 а Бактернальвая культура в 300 мл рабочего объема жидкости при скорости удвоения биомассы 30 миа (О= !,зр ч-'! требует !3,0 л свежей среды в течение 20 ч культивирования Ь Скорость разбавления, иысчитаниая для одного сосуда без рециклиззцчи среды 405 (С большими объемами горячих жидкостей нужно обращаться с предельной осторожностью.
Вместо стеклянных лучше использовать пластмассовые бутыли, которые можно автоклавировать.) Например, для культивирования в течение 20 ч в 14-литровом ферментере с 10-литровым рабочим объемом, в котором клетки бактерий удваиваются каждый час (скорость разбавления 0,69 ч — '), необходимо 138 л свежей среды. При тех же условиях культивирования для рабочего объема жидкости 1 л необходимо 13,8 л среды.
Небольшие объемы среды можно легко автоклавировать и хранить в стандартных 20-литровых бутылях. При приготовлении небольших объемов среды (10 — 14 л) ее удается стерилизовать без избыточного нагревания. Для хранения стерильной среды годятся полнпропиленовые или поликарбонатные бутыли, имеющиеся в продаже. На рис. 10.б схематически изображен типичный резервуар со средой, который стерилизуют в вертикальном положении путем автоклавнрования.
Объем среды не должен превышать 78% объема резервуара, иначе зозможно выплескивание среды во время ее автоклавирования. Кроме того, во время автоклавирования необходимо вы- чАсть и. Рост Рис. 10.0. Резервуар со све. жей средой, стерилизуемый в автоклаве. Трубки 1 и 2 снабжены прижимными колпачкаии для стерильного закрывания. Трубки 1 и 3 снабжены зажимами, а трубка 3 содержит также фильтр для воздуха. Во время работы трубка 1 соединяется с фермеитером специальной муфтой !рнс.
10.7). пустить газ нз сосуда. После стерилизации несколько бутылей можно объединить вместе, увеличив тем самым общий объем резервуара. Для этого трубку 1 первого сосуда соединяют с трубкой 2 второго и т. д. (рис. !0.6). Стерильные соединения сосудов Для соединения сосудов между собой и с ферментером используют специальное устройство, изображенное на рис. 10.7. Оно состоит из двух секций стальных трубок, подобранных таким образом, что одна трубка легко входит в другую. На наружные концы этих трубок плотно надеваются резиновые шланги. Каждую трубку устройства перед автоклавнрованнем заворачивают в алюминиевую фольгу.
Чтобы стерильно соединить их, следует осторожно снять алюминиевую фольгу, обжечь на огне каждую трубку и плотно вставить трубку меньшего диаметра в трубку большего диаметра. Более тонкая трубка должна быть несколько длиннее, чтобы она проходила через всю большую трубку и соединялась с насаженным на нее резиновым шлангом. Для большей надежности место соединения стальной трубки с резиновым шлангом скрепляют проволокой или небольшим стягивающим зажимом. Устройство для быстрого соединения следует располагать таким образом, чтобы более широкая трубка своим открытым концом была направлена вертикально вниз.
Для надежности все устройство заворачивают в стерильный защитный материал, чтобы 1о. жидкАя культуРА АГеагалаачесяая гпрубяа Резанабая мрубяа Рнс. 10.7. Муфта для быстрого и стерильного соединения трубок и сосудов в системе непрерывного культивирования. Ваеряу: муфта в разобранном виде. Внизу: собранная муфта. предотвратить попадание в трубки пыли и содержащихся в воздухе микроорганизмов. Эти предосторожности позволяют разъединять трубки и после стерилизации на огне вновь их соединять.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
