Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 75
Текст из файла (страница 75)
Их надо подбирать так, чтобы они плотно входили в горлышко колбы без дополнительных усилий. Но следует помнить о том, что пробки могут содержать пластификаторы или другие токсичные вещества; поэтому перед использованием их следует тщательно промывать. Колпачки и пробки производятся различными фирмами (например, Аг!)гпг Н. Тйошаз, Яс!епШ!с Ргог(нс(з, Ве!1со О)азз, 1пс.). Поглощение растворенного кислорода жидкой бактериальной культурой зависит от плотности клеток и скорости их роста. Потребность в растворенном кислороде определяется его использованием клетками и удовлетворяется за счет постоянной диффузии кислорода из газовой фазы в жидкую. Область поверхностного контакта между газом и жидкостью часто регулирует поглощение кислорода или объемную скорость его переноса.
Если эта область велика, то скорость переноса больших объемов кислорода также значительна, что позволяет культуре с высокой плотностью быстро расти без лимитирования по Оь Область поверхностного контакта увеличивается при снижении отношения объема жидкости м жидкля культуРА к объему колбы или при встряхивании колбы. Дефицит кислорода, вызванный его ограниченной диффузией, можно свести к минимуму, если заполнять жидкой средой не более 20% объема колбы и встряхивать колбы со скоростью 200 — 350 об/мин на круговой качалке с величиной хода 2,5 см или со скоростью 150 — 250 качаний в 1 мин на качалке с поступательным ходом. Во время инкубации культур в колбах при соответствующей температуре в процессе кругового встряхивания жидкость должна подниматься примерно на 2/3 высоты колбы. Это условие обычно достигается при заполнении 250-миллилитровой колбы Эрленмейера с отбойниками 50 мл среды и вращением ее на качалке со скоростью около 220 об/мин и величиной хода 2,5 см.
Встряхивание на качалке с возвратно-поступательным движением должно быть настолько аффективным, чтобы вызывать значительную турбулизацию жидкости при ее движении от одного края колбы к другому [23]. В используемых при атом колбах с отбойниками происходит разбивание образующихся потоков жидкости при вращении колб на круговой качалке. Такие колбы производятся фирмой Ве1!со 61азз Со. и другими.
Ниже приведена методика культивирования азробных бактерий на качалке в колбах с марлевыми пробками. 1. В 250-миллилитровую колбу Эрленмейера вносят 50 мл соответствующей среды. 2. Делают, как описано выше, марлевую пробку. 3. Пробку кладут на горлышко колбы, надежно закрепляют ее резинкой или пружиной и покрывают сверху алюминиевой фольгой.
4. Фольгу обжимают вокруг пробки и горлышка колбы, чтобы предотвратить конденсацию жидкости во время автоклавнрования. 5. Повторяют зту процедуру со всеми колбами и затем стерилизуют их автоклавированием, как описано в гл. 23 (т. 3). 6. Непосредственно перед инокуляцией удаляют алюминиевую фольгу, 7. Осторожно снимают резинки или поддерживающие пружины, стараясь не сдвинуть пробку. Пробка подходящего размера приобретает после автоклавирования звв чисть и ьос1 форму колпачка 1крышки), прикрывающего входное отверстие колбы и ее горлышко.
8. Марлевую пробку приподнимают и держат ее так, чтобы не допустить загрязнения стерильного содержимого колбы. 9. Горлышко колбы быстро вносят в пламя горелки и вращают его, чтобы выпарить конденсат на его внутренней стороне. 1О. В колбу добавляют ипокулят с соблюдением правил асептики и быстро закрывают ее пробкой.
11. Пробку закрепляют резинкой или металлической пружиной. Описанная процедура предполагает использование таких пробок, которые не препятствуют быстрому газо- обмену и сохраняют стерильность. Если необходима очень быстрая инокуляция, можно не обжигать горлышко колбы; при соответствующем навыке удается сохранять стерильность и в этом случае.
Анаэробная культура Для культивирования анаэробных бактерий можно использовать колбы Эрленмейера, а также любые другие колбы подходящих размеров. При этом необходимо соблюдать два основных условия: 1) питательная среда должна быть восстановлена до величины Еп= — 150 мВ или ниже; 2) воздух из колб следует удалять. Специальные методики, используемые при работе с анаэробными бактериями, приведены в равд. 6.6. При массовом культивировании анаэробов придерживаются следующих основных правил.
Культуральные сосуды заполняют почти доверху, чтобы уменьшить влияние находящейся сверху газовой фазы. Вносят как можно больше инокулята на дно сосуда с восстановленной средой, стараясь держать пипетку вертикально. Воздух в сосуде заменяют очищенным от кислорода азотом илн аргоном с 5 — !О/~» СОь Сначала среду инкубируют без перемешивания, но после того как начинается активный рост, ее перемешивают либо с помощью магнитной мешалки, либо пропусканием азота или другого природного газа через трубку, опущенную на дно сосуда. Используют гидрозатвор, который затрудняет выход газов в 386 кь жидкАя культуРА воздух.
Предостережение: некоторые анаэробные бактерии образуют водород или метан, которые могут загораться или даже взрываться. Большинство анаэробов образуют СОг и другие газы, повышающие давление в сосудах до опасного уровня, если им не обеспечить своевременный выход. 10.1.3. Бутыли Бутыли довольно часто используются для выращивания многолитровых культур бактерий в жидких средах, но существует несколько факторов, ограничивающих их применение. Так, при работе с большими стеклянными бутылями приготовление сред, их стерилизация и инокуляция сильно усложняются.
Кроме того, встряхивание заполненных средой бутылей при аэробном культивировании микроорганизмов небезопасно. (Правда, прн работе с пластмассовыми бутылями опасность значительно меньше.) В больших бутылях очень трудно перемешивать среду даже с помощью мешалок, поэтому создать в ннх достаточно высокую концентрацию кислорода— задача не из легких. Хотя при крупномасштабных работах часто приходится готовить среды в больших бутылях, культивирования бактерий в них следует по возможности избегать. 10.1.4. Ферментеры Описанные ниже ферментеры и соответствующие методы культивирования в ннх в основном используются для выращивания аэробных бактерий, но они вполне пригодны (после небольших модификаций) и для выращивания анаэробов.
Обсуждаемые здесь конструкции ферментеров предназначены для максимального снижения гетерогенности микробной популяции. Другие же ферментеры !например, колонные (р!ид-!!ою), с замкнутым контуром (с!озед-!оор) и трубчатые), хотя и предоставляют интересные возможности для управления гетерогенностью популяции, не обсуждаются в данном руководстве. Основная литература, касающаяся конструкции ферментеров и характера работы с ними, приведена в табл. ! О.!. ЧАСТЬ 11. РОСТ таблица 16.1. Литературные источники данных по конструкции ферментеров и работе с ними И«тенннк данных Предмет Проектирование фермеитеров Общая конструкция [2, 4, 9, 18, 22, 27, 29, 45[ Способ действия: периодический периодический с добавлением субстрата (с подпиткой) непрерывный (проточный) диализный Управление работой фермеитера: теория и логика управления [32, 36[ [16, 32[ [18,43[ [51[ [2, 3, 17, 33, 35, 43, 47, 51 — 53[ [2, 3, 5, 16, 24, 32, 38, 40] Физиологические аффекты: периодическая культура и периодическая культура с добавлением субстрата (с подпиткой) непрерывная (проточная) культура [1, 2, 23 — 25, 37, 41, 54[ [14, 51[ [6, 7, 13[ диализ иммобилизованные клетки Ферментеры, или реакторы с мешалкой для культивирования бактерий, устроены таким образом, что обеспечивают постоянство среды.
Рабочий объем ферментеров колеблется от 500 мл до тысяч литров. Обычные лабораторные ферментеры имеют рабочие объемы от 1 до 20 л. Поскольку они предназначены для того, чтобы максимально уменьшить температурный и химический концентрационный градиент в культуре, среда в них должна перемешиваться таким способом, чтобы достигалось быстрое н полное смешение всех компонентов жидкой фазы. В случае недостаточного перемешнвания возникают застойные зоны, что приводит к появлению неконтролируемых локальных градиентов концентраций.
Если перемешивание слабое, то популяция клеток будет сильно гетерогенной. Например, при слабом перемешиванин аэробных культур контакт между кислородом воздуха и жидкой средой недостаточен, поэтому в некоторых участках ферментера могут создаваться почти анаэробные условия, что лимитирует рост культур. Если куль- 1О жидкая культуРА тивируют факультативно-аэробные микроорганизмы, то дыхательные характеристики разных клеток популяции могут сильно различаться, в результате чего снижается выход биомассы. Ферментер можно сделать кустарным способом в мастерской, причем особое внимание следует уделить устройствам для перемешивания, аэрации и стерилизации, имеющимся в продаже. Необходимо также иметь гарантии асептики покупаемых блоков 112, 20, 31, 391.
Имеющиеся в продаже ферментеры (табл. 10.2) способны обеспечить хорошую азрацию и перемешивание довольно густых культур. Ферментеры обычно оборудованы крышкой с рядом отверстий, через которые вводят датчики рН н растворенного кислорода, а также трубки для отбора проб и введения необходимых питательных веществ. Аэрация и перемешивание Минимальная скорость перемешивания, необходимая для достаточной подачи кислорода, подвержена изменениям, поскольку изменяются такие параметры, как плотность культуры (концентрацня клеток) и условия культивирования (скорость и объем подачи воздуха, температура и объем жидкости в ферментере).
В связи с тем то эта скорость зависит от факторов окружающей среды, управлять процессом культивирования с ее помощью весьма неудобно. Предпочтительнее скорость перемешивания доводить до такой величины, при которой концентрация растворенного кислорода никогда пе падала бы ниже !Π— 15% начальной насыщающей его конц:нтрации.
Поддержание концентрации растворенного а среде кислорода на уровне выше 1Оф, насьпцения при соответствующей температуре позволяет выращивать большинство бактериальных культур в таких условиях, когда кислород не является субстратом, лимитирующим нх рост. Теория перемешивания в барботируемых системах основана на классической кинетике Моно для росса микроорганизмов, чувствительного к лимитирующим его субстратам 11). Требования персмешивания для соотвстству1ощего снабжения культур кислородом почти всегда превышают ЧАСТЬ Н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
