Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 72
Текст из файла (страница 72)
МЕТОДЫ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИИ НА ПОЛУЖИДКИХ СРЕДАХ Полужидкая среда содержит гелеобразующее вещество в низкой концентрации и имеет мягкую желеподобную консистенцию. Такая среда пригодна для культиви- зйз К ТВЕРДАЯ КУЛЬТУРА рования микроаэрофильных бактерий, а также для изу- чения подвижности клеток и хемотаксиса. 9.3.1. Микроаэрофилы Микроаэрофильным бактериям присуще аэробное дыхание, т. е. в качестве конечного акцептора электронов они используют кислород.
Но они не растут в атмосфере с таким содержанием кислорода, как в воздухе (21та). Например, Сатру!обас1ег 1е1из лучше всего растет в атмосфере, содержащей 6$> кислорода. Некоторые азотфиксирующие бактерии могут расти в аэробных условиях прн наличии соединений азота (например, сульфата аммония), но в безазотистых средах ведут себя как микроаэрофилы. Например, Лаозр1гИит в условиях фиксации ИВ лучше всего растет в атмосфере, содержащей 1В/В кислорода. Это происходит из-за инактивации избытком кислорода нитрогеназного комплекса, катализирующего процесс азотфиксации. При условии низкого содержания кислорода микроаэрофилы можно выращивать н в жидких, и на твердых средах, но в этом условии нет необходимости при использовании полужидкой среды с 0,1 — 0,47, агара.
Геле- образующие вещества расслаивают среду таким образом, что конвекционные потоки не способны смешивать богатые кислородом верхние слои среды с нижними. Единственным путем для проникновения кислорода в более глубокие слои пробирки с полужидкой средой является диффузия. Таким образом, в пробирках с полу- жидкой средой создается градиент кислорода, где поверхность среды является местом наиболее высокого содержания кислорода. При инокуляции среды путем укола петлей микроаэрофилы начинают расти несколько ниже поверхности, где концентрация кислорода для них наиболее благоприятна. Рост начинается в форме тонких дисков, которые заметны на расстоянии нескольких миллиметров или сантиметров от поверхности.
По мере роста диски становятся более плотными и перемещаются ближе к поверхности. В конце концов клетки образуют очень плотный диффузный слой непосредственно под поверхностью среды. Лнаэробы, напротив, начинают расти в нижней части полужидкой среды, но впоследст- 369 ЧАСТЪ !!, РОСТ вин могут также расти по всей среде, если создаются анаэробные условия. Мнкроаэрофнл Сатру(обас1ег 1е1из легко культивировать в пробирках с полужидкой средой для бруцелл (бульон для бруцелл, содержащий 0,15 — 0,3' агара; разд.
8.5.14). Азотфнксирующие клетки Агозр1г11(ит хорошо растут в полужидкой среде с малатом, дефицитной по азоту (разд. 8.5.37 или 20.3.4). В литровых бутылях РУ, содержащих слой полужидкой среды, можно получать большие биомассы этой бактерии для физиологических исследований [131. Если пробирки с полужндкой средой хранятся долгое время, кислород может диффундировать в глубь среды. Градиент кислорода удается восстановить после того, как такие пробирки помещают на несколько минут в кипящую водяную баню, а затем дают возможность пробиркам остыть, а среде затвердеть. 9.3.2.
Определение подвижности бактерий Полужндкие среды можно также использовать для определения подвижности бактерий. Для этого пробирку со средой для определения подвижности (бульон, содержащий 0,4!)а агара) инокулируют уколом прямой иглой до середины агарового слоя. В процессе роста подвижные бактерии мигрируют от линии инокуляции, образуя диффузную мутную зону в окружающей среде, тогда как неподвижные бактерии растут только по уколу (лннин инокуляции). Этот метод можно модифицировать следующим образом.
В полужидкую среду помещают открытую с обоих концов и предварительно простерилизованную стеклянную трубочку (рис. 9.3), в которую вносят инокулят. Подвижные микроорганизмы мигрируют вниз, выходят из нижнего конца трубочки и затем начинают двигаться вверх к поверхности среды, где усиленно растут. Этот метод пригоден также для селекции высокоподвижных организмов, используемых для приготовления Н-антигенов при иммунизации. 9.3.3. Хемотаксис Полужидкую среду используют, кроме того, при изучении хемотаксиса. Например, Адлер [11 использовал 370 О.
тВЕРдля культупл полужидкую среду, содержащую окисляемое соединение углерода как источник энергии, для исследования положительного хемотаксиса ЕзсЬет!Сп!а со)!. При внесении большого инокулята в центр чашек Петри со средой клетки Е. со)! мигрируют к периферии в форме расходящегося круга и по мере продвижения используют весь окисляемый субстрат. При добавлении к среде двух окисляемых соединений углерода образуются два кольца из клеток, мигрирующих с различными г.
скоростями. В отличие от методов изучения хемотаксиса в капиллярных трубках в данном случае запас кислорода в чашках с агарнзованной средой никогда не Рис. В.з. Поаужидкаи среда истощается; поэтому мигри- (7) в которую перед автокла. вированием помещен кусочек РУющие кольца клеток по стеклянной трубки 13).
Иноку- яВляются только В ответ вит вносят внутрь стеклянной на сформироВанный этими трубки. Подвижные бактерии клетками градиент субстра мигрируют по тРУбке вниз к дну пробирки, а затем поднима- та, а не на самопроизволь ются к поверхности среды, где ный градиент кислорода, начинают интенсивно расти. С помощью полужидкой среды можно изучать также отрицательный хемотаксис !181, В этом случае клетки Е. Сой суспендируют в среде в концентрации, достаточной для того, чтобы появилось заметное помутнение. Затем инокулированную среду разливают в чашки Петри.
После того как среда приобретает гелеобразную консистенцию, в нее вносят кусочек твердого 2%-ного агара, содержащего предполагаемое репеллентное вещество. Если вещество действительно является репеллентом, то окружающие его бактерии мигрируют в стороны от кусочка агара и оставляют за 24' 37! ЧАСТЬ Н. РОСТ собой прозрачный след, который становится видимым примерно через 30 мин. Использование полужидкой среды позволяет также осуществлять селекцию мутантов, не способных к хемотаксису (2, 181 В случае положительного хемотаксиса эти мутанты (а также неподвижные мутанты) не реагируют на сформированный клетками градиент субстрата и остаются в центре чашки Петри, откуда их можно извлечь для субкультивирования и очистки.
В случае отрицательного хсмотаксиса мутанты, не способные к хемотаксису, можно выделить из прозрачной зоны, окружающей кусочек твердого агара. 9.4. ЛИТЕРАТУРА !. Айег У. СЬето1ахы !п Ьас1ема, Яс(енсе, 153, 708 — 716 (1966). 2. Агта!гона У. В., Айег У., ОаШ М. М. Ноп-сьето!аспс пш1апй о1 Еасйеггсжа сой У. Вас1егго(„93, 390 — 398 (1967) . 3. Воях(ге У. Н., Кметы У. Я. %а1ег грларйу топцог)пйп Ьас1епа аа (пг(!са1огв, т?а.
Ро!у1есь. 1пм. 8(а1е (Уп!ч. %а1ег Цевонг. Сеп1. Вн!1., 69, 19?4. 4. ВТЫхоп Е. у., Вгесйег А. 1)еа!яп апг( гогпш!аиоп о1 сн11нге тейа, р. 229 — 295. 1п: У. й. Ь]огг!в апс( )З. %. й1ЬЬопа (ег(в.), Ме!Ьобв !п т1сгоЬю1оиу, ко1. ЗА, Асаг(еп!!с Ргевв,!пс., Ыеьт Уогй, 1970. 5. Саа!аиена М. У!. А ргас1!са! гпейой 1ог гош!пе Ыоог( снцнгеа и Ьгнсепойа, Ргос. 5ос, Ехр. В1о1. Мей, 64, 1!4 — 1!5 (1947). 6. Сойгег Я. С. Зо(Ы ап4 ао1!йпен кговг1Ь теа!а !п т!сгоЬю!ояу, р.
427 — 454. !п: У. Ц. Хогне апг( 1). %. Ц!ЬЬопа (ейа.), Ме(ьог)в 1п т!сгоЬю1оау, ео1. 1, Асаает!с Ргеав, 1пс., Хевг Уог]г, 1969. 7. Ри~й Н. В., Кги!июв 7. А. Ргерага1юп о1 с)еаг М1(са ке1в йа1 сап Ье в!Теайег), У. Вас!ег!о1,, 88, 1200 — 120! (1964). 8. Оегйагг(! Р., Нег(еп С. 6. Сопсеп!га(еа си1йге о1 попососс( ш с!еаг 119вЫ теашгп, Ргос. 5ос. Ехр. Бю!. Мей, 105, 49 — 51 (1960). 9.
Нан М. М., Миеа)ге С. А., У!х!гнр О. М„Фахй!па!оп У. А., ЬЕ Ета1на1юп о! а Ьгрьайс тейшп 1ог Ыоой си!1нгеа, У. С1!и. М)сгоЫо1., 1О, 673 †6 (1979). 10. Но][тап Р. Н., Оеогае Н. А., Кг(ек М Ус, Бтгаег! У!. М. 5!и!Нее о! йе т!сгоаегорынс пайге о1 Сотру!оьас!ег ]е!их впЬарес(еа ]е!пш', РЕ Цо1е о1 ехоаепооа мрегох!4е ап1опв апа Ьу4гоаеп регох!4е, Сап. У.
М!сгоЬго!., 25, 8 — 16 (1979). 11, Е!пев А. О, ьга!пе о1 йе Кь ва11 о1 саггадеепап ав ап аяаг аньа(1- 1йе и гоп11пе Ьас1еио!ок!са! тейа, Арр!. Епт!Топ, М(сгоЫо!., 34, 637 — 639 (1977). 12. Мерле!! 6. О„Меупеп Е. ТЬеогу ап6 ргас11се !п ехрег1п!еп1а! Ьас1ег!о!ону, СатЬТ!42е Оп(те!в!(у Ргеав, Еопаоп, 1965.
(Имеется перевод: Мейиел Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология (Теория и практика). — Мл Мир, !967,] 13. Ойоп У., А!Ьгесщ Е. Е., Виггм )г. Н. СагЬоп апг( апппоп!а гпе1аЬо!!ат о! Бр!гц1ит Нро]египн й Вас1егю!., 128, 592 — 597 (1976). 372 Глава 10 ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА С.
Дрю Культивирование бактерий представляет собой процесс увеличения концентрации некоторых или всех компонентов популяции. Обычно характеристики этого процесса устанавливаются путем измерений тех или иных его показателей. Чаще всего измеряют увеличение числа клеток или клеточной массы (биомассы). Реже рост оценивают по синтезу макромолекул, когда увеличение количества белка, рнбонуклеиновых кислот, липидов или других макромолекул отражает увеличение биомассы и числа клеток (сбалансированный рост). Однако один или несколько из этих показателей могут не зависеть от других (несбалансированный рост).
Например, на ранней и поздней стадиях роста периодической культуры увеличение биомассы непропорционально числу клеток. В гл. 11 обсуждаются основные аспекты роста бактерий, методы его измерения и допущения, необходимые при использовании каждого метода. В этой главе рассматриваются методы культивирования бактерий в жидких средах объемом от 10 мл до 100 л. Они пригодны для выращивания чистых культур бактерий в водной среде с различной степенью контроля за физическими условиями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
