Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 70
Текст из файла (страница 70)
Особенно чувствительными в этом отношении оказались микроаэрофилы [3, 101. 9.1.2. Каррагенан Каррагенан, давно используемый в пищевой и молочной промышленности, только в последнее время стал употребляться как отвердитель для биологических сред. Он известен также под названием «ирландский мох» или «растительная желатина»; его добывают путем экстракции из определенных видов красных морских водорослей. Существует несколько типов каррагенаиа: каппа, лямбда, мю н йота [171.
Калиевые соли каррагенана типа каппа способны образовывать плотные прозрачные гели, которые могут быть эффективными заменителями агара во многих бактериологических средах [11, 21[, Каррагенан значительно дешевле агара. Подобно агаровым гелям, гели каррагенана можно использовать при посеве штрихом или разливом жидкой культуры. Каррагенан не разрушается большинством видов бактерий, Из него можно готовить гели, устойчивые к тем- 359 члсть и. Рост пературам до 60 'С. Однако каррагенан имеет некоторые недостатки. Высокая температура, при которой еле. дует разливать жидкую среду с каррагенаном по чашкам Петри (от 55 до 60'С), может препятствовать его использованию для выращивания бактерий, когда разведения суспензии клеток вносят в расплавленную среду перед ее затвердением.
Разные каррагенаны заметно отличаются друг от друга 121). Некоторые исследователи обнаружили, что каррагенан не пригоден для полужидкнх сред, в то время как другие считают, что его можно использовать для этой цели (111). В отличие от агара каррагенан может вызывать изменения рН некоторых сред в процессе их приготовления н стерилизации.
Поэтому для каждой среды следует определять, меняется ли и в какой степени значение ее рН при добавлении каррагснана. Для предупреждения таких изменений следует готовить среды с разными исходными значениями рН или увеличивать их буферную емкость. Особенно сильно снижается рН при добавлении каррагенана к средам, содержащим фосфатный буфер 111). Среды с каррагенаном готовят так же, как и среды с агаром.
Каррагенан, классифицируемый при продаже как тип ! (51дгпа С(зеш(са1 Со., Я. 1 он(з, Мо.) и содержащий в основном мох типа каппа и в меньшей степени типа лямбда, оказался пригодным почти для всех целей. Для гелей, устойчивых при 45'С, добавляют 2ф, каррагенана; а для гелей, устойчивых при 60 'С вЂ” 2,4% [! 1). После добавления каррагенана к основной жидкой среде ее кипятят, чтобы пол. постыл растворить его, а затем стерилизуют автоклавнрованием. Стерильную среду охлаждают до 55 — 60'С, разливают в чашки Петри и дают застыть.
Поскольку среду с каррагенаном разливать с помощью пипетки довольно трудно, ее следует разливать непосредственно из бутылей и колб. Конденсирующуюся на геле воду удаляют таким же путем, как в случае применения агара. 9.1.3. Снликагель Отвердение сред с помощью минерального вещества силикагеля применяют для получения культур автотроф- К ТВЕРДАЯ КУЛЬТУРА ных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. Кроме того, при добавлении в такие минеральные среды различных органических веществ можно исследовать способность гетеротрофных бактерий использовать их в качестве единственных источников углерода. С помощью снликагелевых сред можно также определять потребность бактерий в витаминах.
Для приготовления силикагелевых сред существует много различных методов 141. Метод Функа и Кралвича 17) прост, надежен и обеспечивает получение прозрачных и достаточно прочных гелей, на которые без затруднений можно высевать бактерии штрихом инокуляционной иглой или размыванием инокулята с помощью стеклянного шпателя. При их использовании готовят следующие растворы.
Жидкая питательная среда двойной концентрации. Ее готовят, как обычно, и стерилизуют автоклавированием. Раствор силикага калия. К 100 мл 7%-ного (вес/ /объем) КОН добавляют 10 г порошкообразного силикагеля (Ь! 923, 100 — 200 меш, Р!ЕЬег Бс!епИ!с Со., Р!1- !ЕЬпга', Ра.) или кремневой кислоты (геайеп! угаде, 3. Т. Ва!сег СЬеппса! Со., РЬ!!!!рзЬцгд, Ь!.,).) и смесь нагревают до растворения ингредиентов. Разливают в колбы порции по 20 мл и стерилизуют их в автоклаве.
Раствор фосфорной кислоты. Готовят 20%-ный раствор о-фосфориой кислоты из 85%-ной кислоты (сегВВед йтаде; Р!ЕЬег 5с!епИ!с Со.). 20 мл стерильной среды двойной концентрации добавляют к 20 мл стерильного раствора силиката калия. В этот раствор быстро вносят известное количество фосфорной кислоты, достаточное для доведения рН до 7,0 (согласно предварительным экспериментам, около 4 мл). Растворы перемешивают и немедленно разливают в две чашки Петри. Среда начинает затвердевать через 1 мин и становится твердой через 15 мин. Чтобы испарилась конденсированная вода, чашки ставят на некоторое время в термостат.
После инокуляции среды для предупреждения высыхания и растрескивания геля чашки инкубируют во влажной атмосфере. 361 члсть и. Рост 9.2. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ТВЕРДЫХ СРЕДАХ 9.2.1. Массовая культура на твердой поверхности Выращиванием колоний на твердой поверхности получают максимальную плотность бактериальных клеток, поскольку в данном случае жидкость находится только в промежуточном (межклеточиом) пространстве и составляет от 20 до 30% общего объема (27% от плотно упакованных сфер, независимо от их размера). Если инокулят сильно разбавлен, каждая клетка в результате деления дает начало отдельной колонии.
Это может быть полезным для массовой культуры, если отбор колонии ведут по какому-то одному признаку (например, если необходимо вырастить вариант, который образует только «гладкие» колонии). Чаще инокулят бывает не разбавлен, и его равномерно разливают по всей поверхности среды: в этом случае бактерии растут в виде сплошного газона.
Твердую поверхность обычно получают после добавления в среду агара или другого отвердителя. Известно также несколько методов, при которых колонии растут на мембране, помещенной на поверхности жидкой среды в сосуде 1141. Массовая культура бактерий на твердой среде имеет ряд преимуществ по сравнению с культурой в жидкой среде (гл. 10).
1. В случае культур, выращенных на твердой среде, нет необходимости использовать центрифугу или другие средства для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии. Вместо этого на поверхность агара пипеткой наливают небольшое количество стерильного солевого раствора или буфера и суспендируют в нем выросшие колонии с помощью стерильного стеклянного шпателя. Таким способом можно получить большое количество клеток с поверхности агаровых сред в чашках Петри, в больших плоских культуральных матрасах (бутылях типа РУ) и в больших плоских чашках (покрытых крышками из пирекса). Особенно следует избегать центрифугирования при получении большого количества патогенных или к тввРдАя культуРА других вредных бактерий, поскольку при этом образуются аэрозоли.
2. Твердые культуры относительно свободны от макромолекулярных компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как последние обычно находятся внутри агарового геля. Более того, твердые культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов, поскольку для их растворения необходимы значительно большие объемы среды. Следовательно, культуры, выращенные на твердой среде, особенно полезны для приготовления аятигенов или для других целей, когда важна чистота клеточной суспензии.
3. На твердых культурах можно получать результаты, которые невозможно достичь другим путем. Например, плодовые тела миксобактерий и эндоспоры определенных видов Вас(1(из образуются только при росте культур на твердой среде. Это объясняется тем, что лишь здесь бактерии сохраняют между собой физические связи, а также тем, что в данном случае обеспечивается максимальное снабжение кислородом из атмосферы и вымывание продуктов метаболизма (например, кислот) из клеточного окружения. Если этого не происходит, рост культуры подавляется.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
