Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 69
Текст из файла (страница 69)
72 Бгал(ег )?. У. ТЬе Су1ораауа угоир: а соп(г)Ьи(!оп !о 1Ье Ь!о1о8у о1 тухоЬас1ег!а, Вас1ег1о1, Иеч., 6, 143 — 196 (1942). 354 в. пОлучение накопительных и чистых культуР 73 5!ал(ег К. У., Кил(яаюа К., МааНе! М., СоаешВагбе б. Риг(йса1юп апй ргорег1$ев о$ ипюеПи(аг Ыие-бгееп а!две (огйег СЬгоососса)ея), Вас1ег!о1. Кеч., 35, 171 — 205 (197!).
74, Бгалгег К. У., Рабегол! Ь). 7., $$оийогог! М. ТЬе аегоЫс рвеис$о|попайвс а 1ахопош(с в1ийу, й Сеп. М!сгоЬю!., 43, 159 — 271 ($966). 75. 5!о!р Н„Б!агг М. Р. ВйеПои|Ьг|о Ьасгепоиогия беп, е1 яр. п., а ргейа1огу, ес1орагаЫПс апй Ьас$ег(о1убс ш(сгоогаап(вш. Ап1оп1е чап ЕееиисепЬоеЬ, Л. М1сгоЬсо1. Бега!., 29, 217 — 248 (1963). 76. $'ал №е1 С.
В. ТесЬпрйиев !ог йе епг!с$ипеп(, !во!а(!оп апй |па1п1епапсе о! 1Ье рЬо1ояупйебс Ьас1ег(а, Мейойя Епху|по1., 23, 3 — 28 (1971). 77. Уе!Нуатр Н. А в(ийу о1 (чсо шаг(пе абагйесошроя!пб, !асиПа1|. че1у апасгоЬ~с |пухоЬас$епа, й. Ссеп. М(сгоЫо1., 26, 331 — 342 (196$). 78. У|вал|ос ЯГ., Бал!ее М. ТЬе й|оЬас!П|, Вас(епо!.
Кеч,, 21, 195— 213 (1957). 79. Пуагуе б. М., бба!а 5. А. ()ве о! (пЫЬПогв !ог яе(есбче (во!а$!оп апй епшпсга11оп о1 Су1орЬаеая 1гогп па1ига$ виЬв(га1ея, й Ссеп. М(сгоЬю1., 51, 43 — 48 (1968). 80. Ууа(егуигу А В., Б(ал!ег К. У. РаПегпя о1 дгошй апй с(ече)оргпеп1 (п р!еигосарва!сап сувпоЬас1ег(а, М(сгоЫо1. Кеч., 42, 2 — 44 (!978). 81, Ф(ННе! Г., Р!елл(у № А пс|ч паегоЫс, врос(пб, асе1а(е.охЫпбпб яи(!а1е-гейис(пд Ьас(ег(шп, бехи(го!стаса(ит (етепй.) асе!ок(- Наля, АгсЬ. М1сгоЬ~о!., 112, 119 — 122 (1977).
82. (Р!(еу ЯГ. Я., 5!оуея 7. Е,. Кеби1гешеп$ о1 ап аПсабпе рН апй атпюп|а 1ог вибя1га(е ох!йабоп Ьу Вас|!|ия раягеиг((, й. Вас(егю!., 84, 730 †7 (1962). 83. 27|!!!атя М. А., К!г!елбегд 5. С. А 1ахопоппс я1ийу о1 1Ье делив Бр1пПшп ЕЬгепЬега, 1п1. ВиП. Вас(егю!. Ь(ошепс$. Тахоп., 7, 49— 1$1 (1957). 84. $3$$яол б. 5., МПея А. А. Тор!еу апй УУПяоп'я рг1пс(р(ев о1 Ьас(ег!о1обу апй (шшип1$у, 5й ей., ТЬе ТУППашя апй $1|ПЫпя Со., Ва1- 1ипоге, 1964. Глава 9 ТВЕРДАЯ КУЛЬТУРА О.
Криг, Ф. Герхардт Среды в твердом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии с времен Роберта Коха. Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции. Поэтому посев штрихом представляет собой простой и эффективный метод выделения чистых культур бактерий (равд.
8.4.1). Методы посева нанесением жидкой культуры на поверхность твердой среды, глубинного посева и послойного посева также пригодны для подсчета жизнеспособных бактерий (равд. 11.2). Другими методами, основанными на использовании твердых сред, являются посев с помощью бархатных репликаторов (разд. 13.6.2 и 20.2.6), а также ауксанографический метод (разд.
20.2.6). В этой главе мы достаточно подробно рассмотрим основные отвердители, используемые для получения твердых сред, н их применение в бактериологии, поскольку эти вещества в других разделах данного руководства не рассматриваются. Общие подходы к существу данного вопроса отражены в обзоре Коднера 161. 9.1. ОТВЕРДИТЕЛИ 9ЛЛ. Агар Агар получают путем экстракции из некоторых видов красных морских водорослей; это самый распространенный из отвердителей бактериологических сред.
Он состоит из двух полисахаридов — агарозы и агаропектина, причем первый из них составляет около 70% всей смеси. После первой зкстракции агар бывает загрязнен остатками водорослей и другими примесями. Чтобы агар был пригодным для бактериологических целей, большинство 356 9, тВеРдАя культуРА этих примесей необходимо удалить. Опубликован обзор методов экстрагирования и очистки агара в производственных масштабах [41. Подробные сведения о химическом составе и структуре агара можно найти в работах [4, 171. Для бактериологических исследований наиболее важны следующие свойства агара: он не разрушается ферментами большинства видов бактерий, агаровые гели устойчивы к температурам до 65'С или выше, расплавленный агар не превращается в гель, пока не охладится почти до 40'С, и, наконец, агаровые гели имеют высокую степень прозрачности.
В продаже имеются различные сорта агара, причем в большинстве случаев наиболее пригодным является «бактериологический» агар. «Специальный» и «очищенный» сорта агара с пониженным уровнем примесей в основном используются для электрофореза и серологических исследований, но иногда их применяют также при изучении потребностей микроорганизмов в питании. Для очистки бактериологического сорта агара от примесей существует следующая лабораторная процедура [12). Гранулированный агар замачивают в 1О объемах дистиллированной воды на нссколько часов и затем фильтруют; эту операцию повторяют 10 раз в течение 2 дней. Полученный агар погружают в равный объем 95%-ного этанола, оставляют на !2 ч при комнатной температуре и фильтруют. Затем вновь погружают агар иа 4 ч в свежий раствор этанола и фильтруют еще раз.
Добавляют агар к кипящему 95%-ному этанолу, доводят до кипения и фильтруют. Отмытый агар сушат при комнатной температуре. Для приготовления твердой агаровой среды вначале доводят рН основной жидкой среды до желаемой величины и затем добавляют гранулированный агар. Бактериологический агар или агар более высоких сортов незначительно изменяет рН среды. Для получения твердой среды используют 15 — 20 г агара на 1 л, а полужидкой— 1,5 — 4 г/л в зависимости от требуемой концентрации. Для получения среды определенной степени твердости требуются разные концентрации различных марок и сортов агара, поэтому необходимо всегда руководствоваться инструкциями фирмы-изготовителя. чАсть и.
Рост После добавления агара к основной жидкой среде смесь нагревают до кипения, чтобы полностью растворить агар. Если нагрев производится над пламенем или на горячей плите, среду постоянно мешают в течение нагревания, чтобы не допускать осаждения агара на дно, где он может карамелизоваться и обуглиться. Дают среде покипеть приблизительно 1 мин; при этом следят, чтобы агар не вспенивался и не выплескивался через край.
Агар можно также растворить на пару или в микроволновой печи в течение определенного времени. После того как агар растворится, его размешивают для получения равномерной концентрации во всей среде. Расплавленную среду разливают в пробирки, колбы или бутыли и стерилизуют в автоклаве. Примечание. Если требуется агаровая среда со значением рН 6,0 нли ниже, сначала готовят и стерилизуют среду с величиной рН выше этого значения, иначе агар в процессе нагревания будет гидролизоваться и потеряет способность затвердевать при последующем охлаждении среды. Сразу же после стерилизации среды и охлаждения ее до 45 — 50'С к ней добавляют с соблюдением правил асептики достаточное для получения необходимого значения рН количество стерильной кислоты.
Для того чтобы экспериментально определить точное количество кислоты, которое необходимо добавить к основному раствору, полезно приготовить дополнительную порцию среды. Если требуются пробирки со скошенной средой, то сразу же после автоклавнровання их ставят в наклонное положение и дают среде остыть н затвердеть. При приготовлении среды в чашках Петри вначале расплавленную среду охлаждают до 45 — 50'С в водяной бане в течение 10 мин, а затем с соблюдением правил асептики разливают в стерильные чашки (обычно 15 — 20 мл на чашку).
Чашки с агаром накрывают сразу не стеклянными крышками (на них конденсируется влага), а бумагой или другим изолирующим материалом. После затвердения агара на его поверхности могут образоваться капли влаги. Перед инокуляцней дают возможность этой влаге испариться, Хранение чашек в перевернутом положении при комнатной температуре обычно обеспечивает достаточное высыхание агара. Чтобы ускорить ис- 9.
твеРДАЯ кУльтУРА парение влаги, перевернутые чашки помещают на полку воздушного термостата при температуре 45'С, где устанавливают их в наклонном положении. Иикубируют чашки в таком положении до тех пор, пока не исчезнут капли воды. Для некоторых методов посева, таких, как методы с использованием бархатных репликаторов, необходимы чашки с агаром, высушенным более основательно. Для предохранения чашек с агаром от чрезмерного высыхания их помещают в закрытые полиэтиленовые мешки (для этой цели пригодны мешки, в которые обычно запаковывают пластмассовые чашки Петри). Чашки со средой хранят в таких условиях при комнатной температуре в течение 4 — 5 нед. Все жидкие и твердые среды следует хранить в темной комнате или шкафу. Хранение чашек со средами на свету, особенно солнечном, например возле окна, может привести к фотохимическому образованию перекиси водорода илн других токсичных форм соединений кислорода, что способствует иногда ингибированию роста бактерий [16, 201.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
