Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 71
Текст из файла (страница 71)
Вместе с тем выращивание бактерий на твердых средах по сравнению с культивированием в жидкой среде имеет определенные недостатки. 1. Твердая культура имеет ограничения при выращивании больших количеств биомассы. Она дает возможность легко получать граммы клеток; десятки граммов выращивать уже затруднительно, а сотни граммов или килограммы клеток на твердой среде в лаборатории вырастить невозможно. 2. Твердые культуры не обеспечивают однородность популяции клеток в физиологическом отношении. Например, клетки в верхней части твердой аэробной среды (слой глубиной до 1000 клеток) могут находиться в условиях низкого содержания питательных веществ, но высокого содержания кислорода, в то время как в нижних слоях среды условия могут быть противоположными.
3. Твердые культуры характеризуются небольшим числом клеток в пересчете на данное количество среды, збз члсть и гост 9.2.2. Двухфазная массовая культура Преимущества культуры, выращиваемой на твердой среде, сохраняются, а недостатки устраняются при использовании методов выращивания так называемой жидкой/твердой культуры, или двухфазной. Оиа по сущесгву представляет собой форму диализной или диффузионной культуры, где вместо обычной мембраны имеется поверхность раздела фаз, которая как диффузионный барьер отделяет культуру от резервуара с питательной средой и продуктами обмена. Основные положения и история развития двухфазной диализной культуры как частного случая мембранной диализиой культуры даны в обзоре Шульца и Герхардта [141, а методы культивирования с диализом описаны в следующей главе (разд.
10.3.4). Двухфазная система для концентрированной бактериальной культуры систематически изучалась Тир елом и др. 1191. вухфазная система в принципе состоит из толстого слоя затвердевшей питательной среды, покрытого тонким слоем питательного бульона (рис. 9.1). Чтобы приготовить такую систему, частично заполняют сосуд горячей средой, содержащей 2 — 3% агара. После затвердения агарового слоя на него наливают с соблюдением правил асептики небольшое количество питательной среды, засевают ее и инкубируют.
Для выращивания азробов культуральный сосуд помещают на качалку, что обеспечивает хорошее снабжение кислородом и перемешивание среды во время инкубации. Культура развивается в жидкой части среды, но постепенно клетки диффундируют в твердую питательную среду и значительно концентрируются.
Таким способом можно получить популяции с плотностью более 10" клеток(мл, причем данный метод пригоден для выращивания бактерий любого типа. Подходяшим сосудом для такого способа культивирования бактерий является колба Эрленмейера; имеющиеся у ее основания выступы удерживают агар при встряхивании колбы на качалке. Для зтих же целей пригодны прямоугольные сосуды.
Если во время инкубации на качалке агар раскалывается, то следует использовать среду с более высоким содержанием отвер- Ч, ТВЕРДЛЯ КУЛЪТУРЛ Рис. 9.1. Двухфазная система для концентрированной культуры. ! — пробка из ваты и марли, обеспечивающая достаточный доступ воздуха !равд. 11.1.2); 2 — игидкий верхний слой среды (бульона) или водного диффузата; 3 — твердый слой атаровой среды; 4 — выемки у дна колбы, удерживающие агаровую основу и предохраняющие колбу от разбивания при встряхивании на качалке.
Рис. 9.2. Двухфазная система для кулщуры из крови иа твердых и жидких средах 1 — пробка, через которую вводится проба крови; 2— воздух с 1Оа1е-ным содержанием углекислого газа; 3 — твердая агаровая среда; 4 — жидкая среда. дителя. Поскольку перемещение питательных веществ зависит от диффузии, глубина агарового слоя должна быть не более 5 см. Отношение твердой фазы к жидкой должно быть ие менее 4: 1 и не более !О: ! в зависимости от того, что наиболее важно — выход биомассы или концентрация к,четок. Если все компоненты среды присутствуют в агаровом слое, то на него можно нанести слой дистиллированной воды и после уравновепшвания в течение ночи инокулировать бактериями.
В таком верхнем слое можно вырастить относительно чистую и плотную популяцию не 365 ЧАСТЬ 1!. РОСТ которых бактерий, например гонококков, которые обычно культивируют в мутной среде, обогащенной кровью н крахмалом, и для которых характерно образование неплотных популяций 181. Другим примером двухфазной культуральной системы является система, созданная Кастанедой 151 для выделения Вгисейа из крови (рнс. 9.2). Правда, принцип днализа используется в этой системе весьма ограниченно. Для приготовления системы сначала стерилнзуют ЗЪ-ную агаровую среду в прямоугольной бутыли с ватной пробкой, а затем бутыль кладут на бок, чтобы расплавленная среда образовала твердый слой на ее боковой стенке.
После этого бутыль ставят в вертикальное положение, добавляют с соблюдением правил асептики стерильную жидкую среду и закрывают бутыль резиновой пробкой с мембраной. Для некоторых бактерий, таких, как ВгисеВа айог1из, иногда необходимо заменить обычный воздух в бутыли на воздух, содержащий 100/а двуокиси углерода. Пробу крови вводят шприцем через резиновую пробку н инкубируют бутыль в вертикальном положении. Через каждые 2 дня наклоняют бутыль так, чтобы жидкая среда смочила всю поверхность агара, а затем вновь ставят ее вертикально, чтобы среда стекала к дну бутыли.
Прн этом бактерии, находящиеся в жидкой среде, инокулнруют поверхность агара и образуют видимые колонии. Описанный метод имеет ряд преимуществ перед выращиванием бактерий в жидкой среде. Во-первых, нет необходимости многократно открывать бутыль, чтобы получать пробы для мнкроскопнровання или для субкультивирования при определении интенсивности роста. Это уменьшает возможность лабораторного заражения такими высоковирулентными бактериями, как Вгисейа, а также снижает возможность загрязнения самой культуры. Во-вторых, организмы, плохо растущие в жидкой среде, могут лучше расти на поверхности агара.
И в-третьнх, рост бактерий в присутствии окрашивающих и придающих мутность веществ, который трудно наблюдать в жидкой среде, легко обнаружить по развитию колоний на поверхности агара. Последние исследования Холла и др. 19] показали пригодность такой культуральной системы для обнаружения роста многих патогенных бактерий. 366 а ТВЕРДАЯ КУЛЬТУРА 9.2.3. Биоавтографня Биоавтография является вариантом бумажной хроматографии, когда рост бактерий используется как высокочувствительный индикатор для выявления положения определенных веществ на хроматограмме. Метод имеет преимущества специфического определения веществ с биологической активностью, чего лишены химическая и радиоизотопная системы их обнаружения.
Он применим при определении положения на хроматограммах факторов роста из супернатантов культур или клеточных экстрактов, когда концентрация этих факторов настолько низка, что их нельзя обнаружить другими обычными методами. Например, с помощью биоавтографии можно определить на хроматограмме 5 — 10 нг фолиевой кислоты. Примеры использования биоавтографии для определения факторов роста в клеточных экстрактах приведены в работе (151. Биоавтографию широко используют также в фармацевтической промышленности для обнаружения антибиотиков на бумажных хроматограммах [221.
Для определения факторов роста готовят агаровую среду, содержащую все питательные компоненты, необходимые для обеспечения роста определенного штамма, кроме того фактора, который хотят определить. Стерильную расплавленную среду инокулируют при 45— 50'С отмытой суспензией определенного штамма бактерий. Наливают эту питательную агаровую среду в стерильную чашку, достаточно большую для помещения в нее бумажной хроматограммы (чашку можно прикрыть крышкой из пирекса).
После затвердения среды на поверхность агара помещают высушенную бумажную хроматограмму лицевой стороной вниз. При этом обращают внимание на то, чтобы между агаром и бумагой не оставалось воздушного пространства. После инкубации хроматограмму вынимают и находят на агаре зоны наиболее сильного роста бактерий, которые соответствуют местоположениям фактора роста. Внесение слоя воды на поверхность агара часто помогает сделать эти области лучше видимыми. Для успешного проведения биоавтографии выращивание бактерий, используемых в качестве инокулята, обычно проводят в жидкой среде, содержащей мини- Зб7 чАсть !!. Рост мальиую концентрацию определяемого фактора роста. Таким путем удается избежать избыточного накоплении его в клетках бактерий, которое может приводить к не- специфическому росту бактерий иа питательной агаровой среде.
Для достижения максимальной чувствительности рассматриваемого метода определения факторов роста следует использовать высокую концентрацию клеток, высеваемых на агар, чтобы в местах расположения исследуемого фактора иа хроматограмме появились хорошо видимые области скопления выросших бактерий. Наиболее подходящую концентрацию ииокулята определяют в предварительных экспериментах. Контаминирующие бактерии, которые могут присутствовать на бумажной хроматограмме, обычно не мешают определению, поскольку они растут в виде отдельных колоний и нх трудно спутать с более плотным диффузным ростом в агаре индикаторных микроорганизмов.
Тем ие менее количество контаминирующих бактерий следует свести к минимуму. Поэтому высушенные хроматограммы хранят в стерильных конвертах вплоть до использования, а накладывают хроматограммы на питательный агар в помещении, где нет воздушных потоков, переносящих пыль. При биоавтографии антибиотиков агаровая среда должна содержать полный набор питательных субстратов. Это дает возможность микроорганизму расти по всей поверхности среды кроме тех зон, где на хроматограмме находятся антибиотики.
Из-за высокой активности некоторых антибиотиков иногда полезно помещать бумажную хроматограмму на поверхность агара только на короткое время (около 10 мин), а затем снимать ее перед инкубацией чашки. Если надолго оставить хроматограмму на поверхности агара, то зоны ингибироваиия роста бактерий могут быть слишком болыпими, и тогда их трудно отчетливо различать. 9.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
