Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 64
Текст из файла (страница 64)
Обсуждение теоретических аспектов этого метода приводится в работе [511. 8.4.4. Выделение отдельных клеток Обзор различных методов выделения отдельных клеток можно найти в работе [36~. При необходимости ре- 323 ЧАСТЬ П, РОСТ 8.5. СРЕДЫ И РЕАКТИВЫ 8 5.1. Среда для выделения Адиазр(г111ит йгас!1е 1121 кгнрсц О,1 г Агар 10 г Дистиллированнан 1000 ил вода Пептон 5 г 11рожжввой экст- 0,5 г ракт Твин 80 0,02 г 324 гулярного многократного выделения рекомендуется применять микроманипулятор. Для эпизодических выделений используют следующий метод, описанный Ледербергом [42). На нижней стороне чистого предметного стекла тушью чертят сетку квадратов со стороной 5 мм.
Верхнюю сторону стекла стерилизуют над пламенем горелки. После охлаждения стекла его покрыиают слоем вазелинового масла толщиной 0,5 мм (стерилизовать масло нет необходимости) . Нагревают стеклянную трубку диаметром 4 мм в пламени и вытягивают один ее конец так, чтобы получился капилляр диаметром около 0,1 мм. На другой ее конец надевают резиновую трубку. Разводят культуру до плотности 1О' †' клеток бактерий в 1 чл среды и, сжимая резиновую трубку, насасывают суспензию в капилляр. Помещают в центр каждого квадрата каплю суспензии из капилляра под масло.
Капли прилипают к стеклу и расплющиваются до диаметра 0,1 — 0,2 мм. Сканируют стекло с помощью фазово-контрастной или течнопольной микроскопии и определяют, в какой из капель содержится только одна клетка выделяемого мнкроорганизмг. Часто такую единичную клетку извлекают путем многоразового набирания и выпускаиия капли капиллярной пипеткой, содержащей стерильную среду.
По другой методике к капле добавляют примерно 1О мкл стерильной среды и инкубируют на предметном стекле в закрытой камере до появления клона бактерий, а затем извлекают несколько клеток капиллярной пипеткой. Поскольку рост клона происходит в полуанаэробных условиях, эта методика неприменима для строгих аэробов. З. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР Доводят рН до 7,2. Нагревают среду до кипения для растворения агара.
Стерилиауют 15 мин при 121'С. 8.5.2. Среда АЗй)-Ш !59] 1 мл 1000 мл среды дол- О,! г 1000 мл Маннит КгНРОз Ма30 7Н,О Доводят РН до 7,3 — 7,5. Стерилизуют 15 мин при 121'С. 8.5.4. Основная среда для получения накопительных культур Й)то!(оар!г1!1асеае !761 Раствор Аг МаНСОз Дистиллированная вода Стерилизуют фильтрованием (положительное давление). Раствор В: !и'НзС! КНзРОз Мяс(, )з)аС! (для организмов из солоноватой или морской воды) Раствор микроэлементов (см.
ниже) Дистиллированная вода Стерилизуют в течение 15 мин при 121'С. 2г 25 мл 1 г 0,5 г 0,5 г (20 — 30 г) ! мл 975 мл !чаС! МЕС!г 6НгО КС! НаНОз Кгнрог Знго МАЗО, 7Н,О СаС!з 2НгО Лимонная кислота Железоаммонийцитрат ЗДТА, двунатриеаая магниевая соль !з)азСОз Смесь микроэлементов А5 (см. среду В0-11, равд.
8.5.8) Деионизовааная вода После автоклавирования и охлаждения РН жен быть 7,5. 8.5.8. Среда для Аго1обас(ег 2 г Ре50з 7Нг0 0,5 г Дистиллированная 0,2 г вода 25 г 2 г 0,5 г 0,75 г 0,02 г 3,5 г 0,5 г 0,003 г 0,003 г 0,0005 г 0,02 г ЧАСТЬ 11. РОСТ Раствор 02 Хаг5.9НгО Дистиллированная вода 3 г ЙО мл Стерилизуют в колбе с магнитной мешалкой в течение !5 мин при 121'С. После охлаждения добавляют, помешивая, 1,5 мл стерильной 2 М Нг504. Для приготовления среды растворы А и В объединяют. Доводят рН до 7 с помощью стерильных растворов ИагСОз и НзРО4.
При инокуляции первичных накопительных культур на 100 мл среды добавляют 1 мл раствора С. При последующих пересевах начавшей расти культуры К11041озр1г111асеае исключают из среды гчаг$ и заменяют М~ЯО4 на МдС!з. Раствор микроэлементов: ЭДТА, двунатриевая 500 мг СоС14 6Н40 соль СпС!г 2НзО Ге304. 7НзО 200 мг 1Ч!С14 6НзО 2п504 7НзО 10 мг 1ЧагМо04.2НзО МпС1з 4НзО 3 мг Деионизованная н во 30 мг 20 мг 1 мг 2 мг 3 мг вода 1000 мл 8.5.5. Основные неорганические среды А и В 114! Среда А Раствор Ег 11ЧН4) 4304 СаС!з 2НзО МК 504 . 7Н гО Нитрат железа Дистиллированная вода Стерилизуют 15 121 'С Раствор 21 КгНРО, КНзР04 Дистиллированная вода 1,2 г 0,1 г 0,1 г 0,002 г 1000 мл 0,2 г 0,1 г 200 мл Стерилизуют 15 мин при мин при Для приготовления среды растворы 1 и 2 объединяют с соблюдением правил асептики, Для получения твер- дой среды добавляют 20 г агара на 1 л.
326 ЭДТА растворяют в порции воды. Отдельно растворяют в воде другие ингредиенты и добавляют их н раствору ЭДТА. Доводят рН раствора приблизительно до 3, а объем до 1 л. 8. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР 0,8 г 0,2 г 0,05 г (0,5 г РеБОг 7Нго 0,01 г ()г Нг) г50г ! г Дистиллиро. 1000 мл ванная вода Стерилизуют 15 мии при 121'С. Для получения твердой среды добавляют 20 г агара иа 1 л.
8.5.5. Основная минеральная агаровая среда для целлюлолитических цитофаг 1721 ()Чнз) Боз или 1 г СаС!г 0,1 г К)г)О РеС!з 0,02 г К,НРО, ! г Агар 10 г 450,' 0,2 г Водопроводная вода 1000 мл Доводят РН до 7,0 — 7,5, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121'С, 8.5.7. Основная соленая среда для Тйегтиз !11] 100 мкг Доводят рН до 8,2 с помощью ргаОН. ВС-11 159! 8.5.8.
Среда 1,5 г 0,04 г 0,075 г 0,036 г 0,006 г 0,00! г 0,02 г 1,0 мл 1000 мл 0,006 г После автоклавироваиия и охлаждения рН среды дол- жен быть 7,4. Среда В К,НРО, КНгРО, Са50г 2Н,О М950г 7Нго Нитрилотрнуксусная кислота Са50з 2Нго МЕБОг. 7Нзо ЫаС( К)г)ог На)г)оз )г)агНРОз (Чаноз КгНРОг ЗНго МЕ50, 7Н,О СаС!г.2Нго Лимонная кислота Железоаммо. нийцнтрат 60 100 8 103 689 111 мкг мкг мкг мкг мкг мкг ГеС!г МпБОз Нзо Еп50з 7Нго Н ВО Сп50з ЫагМооз 2Нзо СоС1з 6Нго Деионизованная вода ЭДТА, двунатриевая магниевая соль (ЧагСОз Смесь микроэлемен- тов А5 (см.
ниже) Деионизованная вода 2800 нг 22 мкг 5 мкг 5 мкг 160 нг 250 нг 460 нг 1000 мл ЧАСТЬ !1. РОСТ Смесь микроэлементов Абз НзВОз 2,86 мг/мл МпС1».4Н»О 1,81 мг/мл ХпБО».7Н»О 0,222 мг/мл )ЧагМоО» 2НзО 0,39 мг/мл Сн50» 5НгО 0,079 мг/мл Со()ЧО»)г 6Н»О 0,0494 мг/мл 8.5.9. Желчно-эскулииовый агар (ВВ1 или 01(со) Раствор А! Мясной экстракт 11ептон Агар Листиллированная Раствор Вз Бычья желчь Дистиллированная вода 40 г 400 мл 0,5 г 100 мл Смешивают трн раствора и смесь нагревают 10 мин при 100'С. Стерилизуют 15 мнн при 121'С и охлаждают до 50 С. С соблюдением правил асептики добавляют 100 мл 1о/з-ного раствора эскулина, стерилизованного фильтрованием, и смесь разливают в стерильные пробирки для получения косяков.
8.5,10. Агар ВМВ, или картофельный агар [171 Картофель в марлевом мешке кипятят ЗО мин в 1 л воды. Полученный экстракт фильтруют через вату и филь- трат сохраняют. Яблочную кислоту растворяют в 50 мл воды и добавляют 2 капли бромтимолового синего и КОН, пока раствор яблочной кислоты не станет зеленым (рН 7,0), Этот раствор, а также тростниковый сахар, витамины и агар добавляют к картофельному фильтрату. Дистиллированной водой доводят объем раствора до 1 л, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121'С.
3 г 5 г !5 г вода 400 мл Раствор Сз 11итрат железа дистиллированная вода Отмытый, очищенный картофель, нарезанный ломтиками ь-яблочная кислота КОН Нерафинированный тростниковый сахар Раствор витаминов (разя. 8.5.37) Бромтимоловый синий (0,5%-ный спиртовой раствор) Агар Лнстиллнрованная вода 200 г 2,5 г 2г 2,5 г 1,0 мл 2 капли 15 г 1000 мл В. пОлучения ндкопительных и чистых культур 8.5Л1. Модифицированный агар Борде — Жангу 131 125 г отмытого, очищенного и нарезанного ломтиками картофеля в марлевом мешке погружают в смесь, состоящую из 1О мл глицерина и 500 мл воды.
Варят картофель до мягкости и затем выжимают его через марлю в смесь воды с глицерином. Дают жидкости отстояться в высоком цилиндре до относительного про. светлення. Надосадочную жидкость декантируют и доводят ее обьем до 1 л дистиллированной водой. Добавляют 5,б г НаС! с нагреванием, а затем 22,5 г агара, который растворяют кипячением с постоянным перемешнваннем. Смесь стернлизуют 15 мнн при 121'С и охлаждают до 45'С.
С соблюдением правил асептики добавляют 200 мл дефибринированной овечьей крови (равд. 20.3.7), перемешивают и разливают в чашки Петри, Основной агар Ворде-Жангу производится фирмами ВВ1. и 01!со. Доводят рН до б,9. Кипятят до растворения агара и сте- рнлизуют 15 мин при 121'С. 8.5.13. Бульон с желчью, лактозой и бриллиантовой зеленью Раствор Ас Лактоза !О г 20 г Пелтон !О г 200 мл Дистиллированная 500 мл вода Смешивают растворы А и В и доводят дистиллированной водой до 975 мл. Устанавливают рН 7,4, добавля- 8.5.12.
Агар с бриллиантовой зеленью Панкреатический гидролизат казенка П5Р Пептический гидролизат жквотных тканей 138Р Дрожжевой экстракт 1ЧВС1 Лактоза Сахароза Феноловый красный Бриллиантовая зелень Агар Дистиллированная вода (ВВ1. или 1ИСО) 5г 5 г 3 г 5 г 10 г 1О г 0,08 г О,О!25 20 г 1000 мл ЧАСТЬ И, РОСТ ют 13,3 мл 0,1з(е-ного водного раствора бриллиантовой зелени и дистиллированной водой доводят объем до 1 л. Смесь разливают в пробирки, содержапдие перевернутые поплавки, и стерилизуют 15 мин при 121'С.
Доводят рН до 7,0, кипятят до растворения агара и сте- рнлизуют 15 мнн при 121 С, 2,5 г Доводят рН до 7,0 с помон(ью 2 н. КОН. Для получения полужидких сред добавляют 1,5 г агара и кипятят до его растворения. Стерилизуют 20 мин при 121'С. 2,5 г Доводят рН до 7,4, кипятят до растворения агара, стерплизуют 15 мин при !21'С и охлаждают до 56'С. 330 8.5.14. Агар для бруцелл (ВВ1. или Р((со) Панкреатический гидролизат назеина Пептический гидролизат животных тканей Глюкоза Дрожжевой автолизат ЫаС! Бисульфнт натрия Агар Дистиллированная вода 8.5.15.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
