Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 62
Текст из файла (страница 62)
В процессе роста бактерий следят за изменением окраски колоний от розового до цвета охры. Поскольку сульфид, образуемый /7. псе/ох!Ыапз, ингибирует рост данной бактерии (предсльная концентрация Н,Б, которую она выдерживает, составляет 0,1%), был предложен альтернативный метод получения ее накопительной культуры„при котором среду, содержащую серу, инокулируют не только пробами ила и воды, но также чистой культурой зеленых серных бактерий из сем. Сй(огоИасеае, Этн бактерии постоянно потребляют выделяемый в процессе роста Р. псе(охЫапэ Нс8 и окисляют его с образованием элементной серы, которая 314 К ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЬ|К КУЛЬТУР используется быстро растущей накопительной культурой Р, асе1охЫалу.
Такой метод можно применять и для выделения чистых культур Р. псе!ох!т!алу [561. 8.2.32. Толуол как субстрат для окисляющнх его бактерий [14) Для получения накопительных культур бактерий, окисляющих толуол, используют основную неорганическую среду А нли В (разд. 8.5.5) в закрытых ватными пробками колбах. Среду инокулируют небольшим количеством влажной почвы, предварительно обработанной в течение нескольких дней парами толуола, или свежей почвой. Колбы инкубнруют 1 — 3 нед при 25 — 30'С в закрытой камере, содержащей стакан с водой, насыщенной толуолом.
Отдельные колонии получают, делая посев выросшей культуры штрихом на твердую среду и инкубируя чашки при 25 — 30'С в атмосфере, содержащей толуол. 8.2.33. Бактериальные клетки как субстрат для миксококков Виды Мдхососсиу способны с помощью литических ферментов лизировать клетки других бактерий и использовать высвобождающиеся при этом вещества для своего роста. Можно воспользоваться этой особенностью при выделении миксококков из проб почвы, воды или растительного материала [47, 55, 66); Бактериальные клетки, используемые в качестве субстрата (пригодны ЕП1егоЬас1ег аегонепеу), получают, либо снимая целую колонию диаметром 4 мм с поверхности агаровой среды, либо центрифугируя бактерии, выросшие в жидкой среде и отмывая их несколько раз.
На поверхность водноагаровой среды (1,бала агара в дистиллированной воде) миксококки высевают полоской нли мазком около 1 см шириной и 4 см длиной. Мазок должен быть достаточно толстым, чтобы его можно было видеть невооруженным глазом. На один конец мазка помещают две или три частицы почвы или кусочки растительного материала, например норы или листьев. Через 2 — 3 дня и затем с однодневными интервалами исследуют чашки с помощью препаровальной лупы, чтобы убедиться в рас- 315 ЧАСТЬ Н РОСТ творении бактернального мазка вокруг добавленных частиц, Следят также за появлением на мазке и по его краям плодовых тел обычно желтого, оранжевого или розового цвета.
Плодовые тела, обнаруженные на наибольшем расстоянии от мазка, переносят на агаровую среду, содержащую 0,27, тряптона или казитона (0Исо ).аЬога1ог(ез, Ве1го11, М(сЬ.) и 1,54, агара. Перед посевом для высвобождения миксоспор каждое плодовое тело раздавливают в капле стерильной воды между двумя предметными стеклами. Добавление циклогсксимида (25 мкг/мл) в непитательную агаровую среду и в последующие среды задерживает рост грибов, способствуя таким образом выделению миксококков [55]. 8.3.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЪ| 8.3.1. Бактериальный паразитизм бделловибриоиов 1751 Крошечные вибрионы, названные бделловибрнонами, способны прикрепляться к различным грамотрицательным бактериям, проникать через их клеточную стенку и размножаться в периплазматическом пространстве с последующим лизисом бактерии-хозяина.
Метод выделения бделловибрнонов во многих отношениях напоминает метод, используемый для бактериофагов. 500 г почвы суспендируют в 500 мл водопроводной воды и энергично встряхивают в течение 1 ч. Суспен зию центрифугируют 5 мин при 500 и для осаждения больших частиц, Надосадочную жидкость пропускают через мембранные ультрафильгры, постепенно уменьшая размер пор в следующем порядке: 3; 1,2; 0,8; 0,65 и 0,45 мкм. 0,5 мл полученного фильтрата смешивают с 0,5 мл суспензии ( — 5 1О" клеток в 1 мл) бактерий- хозяев ГЕл1егобас1ег аегойепез нли Рзеиг)отопаз )1иоге*селз).
Эту смесь добавляют к 4 мл расплавленной полужндкой среды УР (равд. 8.5.60), перемешивают и наливают на поверхность твердой УР-среды в чашки. После инкубирования в течение ночи проверяют появление на среде бляшек (областей лизиса). Если они образуются в течение 24 ч, то это более характерно для К ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР бактериофагов, чем для бделловибрионов, которые обнаруживаются не ранее чем через 2 сут.
Бляшки, в которых предполагают присутствие бделловибрионов, срезают и суспендируют в УР-среде. Затем готовят серию разведений для наслаивания на газоны бактерий-хозяев с целью получения изолированных бляшек. Одну из бляшек исследуют фазово-контрастной микроскопией с целью найти очень подвижные крошечные вибрионы шириной около 0,8 мкм. Материал, полученный из бляшек, суспендируют в УР-бульоне, суспензию пропускают через ультрафильтр с диаметром пор 0,45 мкм, фильтрат разводят и наносят его на газоны бактерий-хозяев.
После трех последовательных выделений из бляшек можно считать, что полученные штаммы бделловибриона вырастают из одной клетки. 8.3.2. Симбиоз растений с ризобиями 15'1 Клубеньки, образуемые на корнях бобовых растений, представляют собой природную накопительную систему симбиотических азотфиксирующих бактерий рода 1т(т1- ЕОИит. Корни люцерны или красного клевера, содержащие клубеньки, отмывают от земли. Отделяют клубеньки от корня так, чтобы небольшая часть корня оставалась с клубеньком. С помощью волосяной щетки промывают клубеньки водопроводной водой, удаляя остатка земли, и погружают их в раствор НЕС!У (1: 1000) на 3 — 6 мин, время от времени переворачивая стерильным пинцетом. Переносят клубенькн в 75'/в-ный этанол и несколько минут встряхивают. Затем помещают их в стерильную воду и взбалтывают смесь еще несколько минут.
Наливают по 1 мл стерильной воды в шесть стерильных чашек Петри. В первую чашку кладут клубенек, раздавливают его стерильным пинцетом и добавляют к нему воду. Переносят 1 — 2 петли полученной сус. пензии во вторую чашку со стерильной водой и перемешиваюг. Проводят суспензию таким же образом через оставшиеся чашки. К каждому разведению добавляют расплавленный и остуженный до 45'С агар с дрожжевым экстрактом и манннтом (равд. 8.5.59).
Инкубируют чашки с затвердевшей средой при комнатной температуре и получают затем субкультуры из отдельных колоний. 317 чАсть и, Рост 8.3.3. Заражение животных для получения культур Зггер1ососсиз рпеитол1ае 120] Патогенный микроорганизм можно выделить, инокулируя животное-хозяина смешанной культурой, в которой ои находится. В инфицированном животном патогенный микроб преобладаст н часто обнаруживается в виде чистой культуры в крови и тканях. При этом в результате действия за1цитных механизмов животного рост непатогенных сопутствую1цих микроорганизмов ингибируется или они гибнут. Например, чистую культуру пневмококков можно получить через 4 — 6 ч после внутрибрюшинного введения мыши 1 мл эмульгированной мокроты, содержащей 5. рпеитотае и другие бактерии.
Пробы перитонеальной жидкости берут из брюшинной полости животного с помощью стерильной остроконечной капиллярной пипетки. 8.3.4. Инфицирование животного возбудителем чумы Уега1та рез11з Выделение из разлагающихся трупов животных Уегз1л1а резйз затруднено из-за присутствия большого количества бактерий, вызывающих гниение, Для получения накопительных культур у рез11з разлагающийся материал втирают в выбритую кожу живота морской свинки. Благодаря малым размерам клетки У. рез11з быстро проникают через микроскопические царапины на бритой коже и инфицируют животное, тогда как большинство сопутствующих бактерий имеют размеры, не позволяющие им проникать через кожу, Чистые культуры У.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
