Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 57
Текст из файла (страница 57)
8.!.18, Освещение при получении культур одноклеточных цианобактерий 159, 731 Для выделения пресноводных цианобактерий (сине- зеленых водорослей) пробы нз прудов, ручьев илн водных резервуаров вносят в пробирки со средой ВО-1! (рнзд. 8.5.8). Для выделения морских цианобактерий используют среду М~ч (разд. 8.5.32); если некоторые из ннх плохо растут на этой среде, то предпочтительнее пользоваться средой АВХ-П! (разд. 8.5.2). Всю стеклянную посуду следует вручную и хорошо прополаскивать водопроводной водой, концентрированной азотной кислотой и затем деионизованной водой.
Накопительную культуру ннкубируют в водяной бане на свету прн 35 'С; при этой температуре подавляется рост большин. ства водорослей. Пользуются флуоресцентной лампой нли лампой накаливания с освещенностью 2000— 3000лк. Для некоторых цианобактерий освещенность следует снизить до 500 лк или ниже. Накопление культуры периодически контролируют до тех пор, пока не убеждаются, что начался рост цианобактерий. Тогда их высевают на поверхность среды, содержащей 28(8 агара бактериологической степени очистки. Чашки инкубируют в условиях постоянной освещенности (~500 лк) при 25'С на воздухе или в атмосфере, слегка обогащенной СО,; для предотвращения испарения в качестве камер следует использовать прозрачные пластмассовые коробки, например из-под овощей.
С помощью прспаровальной лупы выявляют компактные, сильно пигментироваиные колонии неподвижных цианс 299 ЧАСть 11. РОСТ бактерий. Для того чтобы избежать контаминации другими бактериями, может быть необходим многократный рассев культуры. При работе с подвижными цианобак. териями небольшую порцию культуры помещают на одну сторону чашки Петри с агаровой средой.
Если освещать чашку с противоположной стороны, то цианобактерии начнут перемещаться по поверхности агара в область с большей интенсивностью света. После того как часть микроорганизмов достигнет противоположной стороны чашки Петри, делают пересев в новые чашки столько раз, сколько это необходимо для того, чтобы избавиться от посторонних бактерий. Этот метод был также успешно использован для выделения некоторых нитчатых цианобактерий [731. Для медленнорастущнх пианобактерий, таких, как некоторые штаммы Р!Ригосарза1ез, исходную культуру можно получить прямым выращиванием колоний на твердой среде, что предпочтительнее, чем предварительное культивирование в жидкой среде [801. Во время транспортировки обломков камней, раковин, моллюсков нли обрывков крупных водорослей из зоны прилива в лабораторию образцы сохраняют в закрытых бутылях или пробирках, содержащих кусочек влажной фильтровальной бумаги.
Образцы не следует погружать в морскую воду, так как это способствует развитию посторонних микроорганизмов. В лабораторных условиях делают соскобы с природных субстратов и суспендируют их в стерильной жидкой среде, а также рассевают в несколько чашек.
Если в суспензии содержится много посторонних микроорганизмов, необходимо снизить нх количество, прежде чем рассевать по чашкам. Для этого суспензию промывают несколько раз стерильной средой путем центрнфугировання с низкой скоростью. Для проверки чистоты культур цианобактерий пользуются микроскопом, а также инкубируют культуры на комплексных средах в темноте при 30'С.
8.1.19. Освещение при получении культур Ю1одозр1гШасеае [761 Несмотря на то что представителей сем. Иодозр1111- !асеае относят к пурпурным несерным бактериям, ряд видов этого семейства может использовать в качестве З. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР донора электронов сульфид. Однако это происходит лишь в том случае, когда концентрация сульфида поддерживается на низком, нетоксичном уровне.
Поэтому данные микроорганизмы обычно выращивают на средах с органическими донорами электронов, Используя различные источники углерода и витаминов, можно получить культуры тех или иных видов пурпурных бактерий. Как правило, в среду добавляют такие субстраты, которые не могут сбраживаться нефототрофными микроорганизмами, Виды Йподозр!г!!1асеае довольно легко выделяют из пресной воды и морских осадков; труднее изолировать их из почвы полей, газонов и садов. Для получения накопительных культур используют основную среду (равд. 8.5.4) с добавками, указанными в табл. 8.1, О,! г образца вносят в пробирку с завинчивающейся крышкой и полностью заполняют ее средой, так чтобы между средой и крышкой не было воздушного пространства. Инкубируют при 25 С и при постоянном освещении лампой накаливания (50 — 75 Вт) с расстояния 40 — 60 см.
Необходимо убедиться, что пробирка при этом не нагревается. В течение 3 — 7 дней наблюдают за увеличением мутности культуры, имеющей коричневую, желтую или розовую окраску. Затем переносят каплю культуры в другую пробирку со средой (табл. 8.1) для вторичного накопления.
Для очистки культуры используют твердую среду, содержащую 1% дрожжевого экстракта или пептона, 0,2% малата натрия и 1,5% агара. Засеянную среду разливают по чашкам Петри или в пробирки (разд. 84.2). Инкубацию проводят в анаэростате с постоянным освещением. Многие виды Йпойозр!г!Иасеае способны также расти в темноте в атмосфере воздуха или в мнкроаэробных условиях, однако в этих случаях колонии менее пигментированы, чем при их росте на свету в анаэробных условиях. 8.1.20.
Освещение при получении культур Спгоп>а()асеае и Сп)огоЬ!Есеае Фототрофные серобактерии, принадлежащие к сем. Спгоща1!асеае н С!1!ОгоЫасеае, культивировать значительно труднее, чем пурпурные несерные бактерии, хотя Субстрат Виды Витамины первичная накопительная культура вторичная иакопнтельна» ь]льтура Б-Алании (3 г/л) Пропноиат (2 г/л) Этанол или ацетат (2 г/л) Пропионат (2 г/л) Кйог(озр!гг!!ит гибгот Ййог(орзеиг(атопаз сорди!п!а Биотин (20 мкг/л) Тиамин (1 мг/л); для некоторых штаммоа нужны также биотин и ниацин Биотнн (20 мгк/л); тиамии (1 мг/л); для некоторых штаммов нужен также пантотенат Биотин (20 мкг/л); тиамин (! мг/л); ниациа (! мг/л) п-Аминобензойная кислота (200 мкг/л); для некоторых штаммоа нужен также биотин и-Аминобензойная кислота (200 мкг/л) Не нужны Изопропанол (2 г/л) Изопропанол (2 г/л) Кйаг/орзеиг!отапаз де!а!1- по.та ъ О ы Ййог(орзеиг)отопил зрйего1- г(ез Кйог(орзеийотопаз ра!из!из Зтанол или ацетат (2 г)л) Бензоат (0,5 г/л] Тартрат (3 г/л) Тиосульфат (2 г/л) Пеларгонат (0,3 г/л) Кйог)озр!г(!!ит (и!иит То же Сукцннат (2 г/л); р Н среды довестн до 5,! Пеларгонат (0,3 г/л) Сукцинат (2 г/л); р Н среды довести до 5,1 Пеларгонат (0,3 г/л) Кйог)орзеиг(отопил аси(арй! !а Ййог(озр(г(!!ит !епие ' Состав основнон среды дая накопления см в раап.
а б 4 Таблица 8.1. Субстраты н витамины, дооавляемые к основной среде' для получения накопительных культур КЬобозр1П11асеае (78) К ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЪ|Х И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР их массовое развитие («цветение») дольно часто можно наблюдать невооруженным глазом, особенно в морской или солоноватой воде. Однако, если «цветения» не наблюдается, полезно для получения накопительных культур использовать колонку Виноградского. Прн этом обеспечиваются анаэробные условия и длительное снабжение Н,5, что приводит к обильному росту фототрофных серобактерий, впрочем как и многих других микроорганизмов. Для приготовления колонки Виноградского используют ил из пресных, солоноватых или морских водоемов, например из береговой части прудов, ручьев, озер илн соленых болот.
Смешивают 3 части этого ила с од. лой частью Са504 Н,О и добавляют немного нерастворимых органических веществ в виде фильтровальной бумаги или корней водных растений. Если используют фильтровальную бумагу, то добавляют также небольшое количество 5)НВМцРО4. Смесь переливают в высокий стеклянный цилиндр диаметром не менее 5 см и вы. сотой не менее 15 см н перемешивают ее так, чтобы не образовывались воздушные полости.
Заполняют цилиндр водой (для выделения морских микроорганизмов используют морскую воду) и проводят инкубацню в темноте в течение 2 — 3 дней, чтобы свести к минимуму развитие фототрофных микроорганизмов, выделяющих кис. лород, Цилиндр оставляют при 18 — 25'С под лампой накаливания или при естественном освещении в течение всего периода ннкубацни. Анаэробный распад органического материала в колонке, сопровождающийся образованием СО„спиртов, жирных кислот, окснкислот и других органических кислот н аминов, а также образованием НВ5 из Са504, обеспечивает рост многих микроорганизмов. Прн этом фототрофные серобактернн образуют характерные пурпурные, красные или зеленые пятна на стенках цилиндра либо слой или полосы в колонке над границей раздела фаз осадка н воды.
При сборе бактерий со стеклянной поверхности или из отдельных слоев для микроскопнрования, выделения или дальнейшего накопления в жидких культурах пользуются пастеровским14 пипетками. Можно также последовательно сннмать порции осадка ложечкой или шпателем. Накопительные культуры можно также получать, ис- ЧАСТЬ ГЬ РОСТ пользуя синтетические жидкие среды. Среды для отдельных видов фототрофных серобактерий подбирают, варьируя условия их культивирования, длину волны света, его интенсивность, температуру инкубации, а также донор электронов и его концентрацию.
Болеедетальное обсуждение возникающих прн этом проблем можно найти в очень полезной работе ван Нила [76!. 8.1.21. Ультрафиолетовое облучение при получении культур цианобактерий Очень часто трудно получить культуры цианобактерий, свободные от посторонних микроорганизмов, которые нередко проникают в слизистые чехлы, окружающие клетки и нити цианобактерий. Герлоффу и др, [221' удалось очистить культуры цианобактерий от сопутствующих форм следующим способом.
Разведенную суспензию цианобактерий помещали в кварцевую камеру и облучали ультрафиолетовым светом (275 нм), излучаемым покрытой кварцевой рубашкой ртутной лампой. Во время облучения суспензию постоянно перемешивали. При правильно выбранном времени экспозиции сопутствующие микроорганизмы погибали, тогда как цианобактерии оставались жизнеспособными. В процессе облучения периодически отбирали пробы и готовили из них болыпое количество разведений. Разведенные культуры, в которых выявлялся рост циаиобактерий, проверяли на присутствие посторонних форм, микроскопируя пробы, а также высевая их в разные среды.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
