Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 52
Текст из файла (страница 52)
РОСТ Организм 5. еди1лиз АТСС 8042 получен из Американской коллекции типовых культур (1230! РагЫа1ип Рг(че Коскч1!1е, МР 20852). Основную культуру бактерий поддерживают в столбиках со средой, состоящей из 1,5% агара, 1% глюкозы и 1% дрожжевого экстракта. Один раз в месяц культуру пересевают на свежую среду. Столбики инкубируют 24 ч при 37'С. Посев делают в 2 пробирки. Одну из них оставляют на хранение и используют только при последующем пересеве через месяц. Другую используют для приготовления инокулята, применяемого при анализах.
Полная основная среда Состав основной среды приведен в табл. 7.14. Поскольку зто сложная среда, ее можно приготовить несколькими способами, причем каждый исследователь может выбрать любой из предложенных здесь вариантов. Удобнее всего смешать различные вещества (например, аминокислоты, минеральные соли, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины), которые можно хранить либо в твердой форме, либо в виде основных растворов. Затем к этой смеси добавляют необходимые компоненты в нужном количестве и готовят соответствующее количество среды, концентрация которой вдвое выше требуемой (так называемая среда с двойной концентрацией). В аналитических целях отдельные вещества, подлежащие определению, следует исключить из таких смесей.
Смеси готовят следующим образом, Аминокислоты, Делают навески аминокислот в количествах, указанных в табл. 7.!4. Аминокислоты, предназначенные для определения, исключают из смеси. Приготовленные навески смешивают, растирают в ступке и хранят в хорошо закупоренной банке в темном месте. Смеси всех аминокислот, предназначенных для аналитических целей, готовят и хранят таким же способом. Известно, что активны только (.-изомеры аминокислот.
Из соображений удобства иногда используют Р1- Таблица 7.!4. Состав полной синтетической среды для 8!тер!ососсиз есшлиз Количеетио не ! л среды е двойной иои- центрицией Компонент 1,2 г 1,2 г 400 мг 20 мг 40 мг 20 мг 20 мг 20 мг 20 мг 20 мг 1 мг 2 мг 0,6 мг 0,6 мг К БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Лминокислоты: Р1.-а-Алании 1.-Лргииии. НС! Р-Аспарагин С-Лспарагиновая кислота 1.-Цистеин 1.-Глутамивовая кислота Глицин 1.-Гистидин НС1 01.-Изолейцип 01.-Лейцин 01.-Лизин.НС! Р1.-Метионин 01.-Фенилзлаттин 1.-Пролив 01.-Серии 01.-Треонии 01.-Триптофан 0-Тирозин Р1.-Валин Глюкоза Лцетат натрия Хлористый аммоний Неорганические соли: КНеРОе КеНРОт МКВОе 7НеО РебОе 7НтО МПБОе 4НгО 1йаС! Пуриноиые и пиримидиновые основзиия: Лденинсульфат. Н,О Гуанин ЙС! Н,О Урании Ксантин Витамины: Тиамин НС! Пирндоксин НС! Пиридоксамин НС! Пиридоксаль НС! 400 мг 484 мг 800 мг 200 мг 100 мг 600 мг 200 мг 124 мг 500 мг 500 чг 500 мг 200 мг 200 мг 200 мг !00 мг 400 мг 80 мг 200 мг 500 мг 50 г 40 г б г чАсть и Рост Продолжение табл.
714 Количество на 1 л среды с двойной концентрацией Компонент Р1.-Пантотена г кальция Рибофлавин Никотиновая кислота а-Аминобенаойиая кислота Биотин Фолиевая кислота Дистиллированная вода 1 мг 1 мг 2 мг 0,2 мг 0,002 мг 0,02 мг До 1000 мл 204 изомеры. Если, например, 1-изомер отсутствует, а есть РЕ-изомер, то последнего берут в 2 раза больше.
Минеральные соли, Солевой раствор А получают следующим образом: 25 г КНйРО» я 25 г КйНРО» растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 250 мл. Остальные соли объединяют в следующих количествах: 10 г Мд504.7НйО, 0,5 г Ре50» 7НйО, 0,8 г Мп504 4НйО и 0,5 г 14аС1. Смесь растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 250 мл и добавляют 1 каплю концентрированной НС1, чтобы предотвратить образование осадка !солевой раствор В). Оба раствора устойчивы при комнатной температуре, но лучше хранить их в холодильнике, чтобы предупредить рост плесени в растворе А и окисление Ге'4 в растворе В. Лрриновь»е и пиримидиновь»е основания. Ксантин и гуанин растворяют при нагревании в разбавленной НС1; аденин и урацил растворяют в теплой воде.
Смешивают эти растворы и добавляют к ним столько воды, чтобы концентрация каждого основания в смеси была 1 мг/мл. Раствор устойчив при хранении в холодильнике. Витамины. Смешивают все витамины, за исключением биотина и фолиевой кислоты, причем количество каждого нз них должно быть в 10 раз больше, чем указано в табл.
7.14 Исходные растворы биотина и фолиевой кислоты каждый с концентрацией 1 мг)мл готовят отдельно. Бнотин солюбилизируется при нагревании; для лучшего растворения фолиевой кислоты добавляют небольшое количество 1)Н»ОН. После того как в смесь Т БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ витаминов внесли 0,02 мл раствора биотина и 0,2 мл раствора фолневой кислоты, объем доводят дистиллированной водой до 60 мл и смесь нагревают до растворения всех компонентов, Храняг этот раствор при 5 'С и меняют каждые две недели. Глюкоза, ацетат нптрил и хлористый ал4монии.
Сначала делают навески глюкозы, ацетата натрия и хлористого аммония. Для приготовления 500 мл основной среды с двойной концентрацией взвешивают 3,1 г смеси аминокислот (не учитывая вес исключенных из нее аминокислот) и растворяют ее нагреванием примерно в 400 мл воды, Добавляют последовательно 25 г глюкозы, 20 г ацетата натрия, 3 г 1(Н4С1, 6 мл солевого раствора А, 5 мл солевого раствора В, 1О мл основного раствора пурнновых и пиримидичовых оснований и 3 мл раствора витаминов.
Объем доводят дистиллированной водой до 500 мл, а рН среды устанавливают 6,8, (Описанная и сходные с ней среды продаются, например фирмой Р!(со 1а)4ога1ог(ез ) Приготовление образцов Для получения правильных результатов в анализируемых пробах необходимо, чтобы факторы роста в них были в той же химической форме, что и вещество, используемое в качестве стандарта.
Так, белки следует тщателыю высушить перед взвешиванием и полностью гидролизовать (Многие пептиды могут поступать в клетки и гидролизоваться, поставляя тем самым лимитирующие аминокислоты; однако количественный ответ на входящую в состав пепгида аминокислоту может не соответствовать ответу на свободную аминокислоту.) Можно пользоваться любой методикой для полного гидролиза, гарантирующей незначительное разрушение аминокислот. Для определения аргинина образцы белка высушивают нагреванием в течение 3 ч при температуре 60 'С под давлением 20 мм рт. ст. (2,7 кПа).
Тщательно взвешивают около 200 мг образца, помещают его в пробирку из пирексового стекла размером 25Х200 мм, добавляют 10 мл 4 н. НС!. Пробирку закрывают и автоклавируют 8 ч под давлением 103421 Па. После охлаж- ЧАСТЬ П. РОСТ дения пробирку открывают, нейтрализуют ее содержимое (рН 6,8) и доводят его до нужного объема. Некоторые аминокислоты (частично триптофан и тирозин и в меньшей степени некоторые другие аминокислоты) разрушаются при кислотном гидролизе.
В этом случае следует использовать другие методы. Аминокислоты, которые используются в качестве стандартов (в данном случае аргинин), также высушивают в течение 2 ч при 60'С при давлении 20 мм рт. ст., тщательно взвешивают и растворяют в воде. Методика определения Инокулят готовят следующим образом. В пробирки вносят полную среду С с двойной концентрацией (табл.
7.14), содержащую 0,2с(а дрожжевого экстракта, разбавляют равным объемом дистиллированной воды, отбирают аликвоты объемом по 1О мл в культуральные пробирки, закрывают пробками и стерилизуют автоклавированием. Некоторые пробирки с инокулятом можно приготовить заранее и хранить при 5'С. За день до определения с помощью инокулирующей иглы переносят часть бактерий с соблюдением правил асептики с агарового косячка в другую пробирку со средой и инкуби. руют ее при 37 'С в течение 15 в 18 ч. Непосредственно перед экспериментом клетки собирают центрифугированием.
Надосадочную жидкость декантируют, а клетки суспендируют в 10 мл стерильной воды. Вновь центрифугируют и суспендируют клеточный осадок в 10 мл стерильной воды, получая таким образом отмытую суспензию бактерий для последующей инокуляции. Определение проводят в пробирках размером 18Х А!50 мм без бортиков, помещенных в металлический штатив. Если о росте судят по образованию кислот, то, как рекомендуют Стил и др.
[216), общий объем среды должен быть не менее 2 и не более 10 мл. Для турбидиметрических измерений общий объем должен составлять 10 мл, что н выполняется в описываемом ниже эксперименте. Стандартную кривую получают путем разведения О, 20, 40, 60, 80, 100, 120, !60 и 200 мкг 1.-аргинина НС! в 10 мл общего объема. В пробирки вносят пробы в ко- Т, ВИОХИМИЧВСКИВ ФАКТОРЫ личествах, соответствующих концентрациям аргинина от 10 до 100 мкг на 1О мл. Дисгнллированной водой доводят объем в каждой пробирке до 5 мл и затем добавляют по 5 мл среды с двойной концентрацией. Пробирки закрывают, стерилнзуют авгоклавнрованием в течение 1О мин под давлением 103421 Па, охлаждают и инокулируют отмытой клеточной суспензией, полученной, как описано выше.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
