Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 56
Текст из файла (страница 56)
8.5.58) для получения отдельных колоний. 8 1.10. Использование роения клеток С!оз1гмйит (е(аа( для получения их культур (711 Пробы из почвы, испражнений животных и клинического материала инокулируют в небольшой участок свежеприготовленного кровяного агара (равд. 20.3.7). Чашки инкубируют прн 37 С в анаэростате в течение 1 дня и затем внимательно исследуют поверхность агара на наличие так называемой зоны роящихся клеток (швармеров), которые в виде тонкой пленки распространяются за пределы зоны инокуляции.
Для того чтобы убедиться в существовании процесса роения, иногда полезно поскрести иглой поверхность агара Отбирают пробы с края зоны роения и переносят их в бульон, а затем рассевают по поверхности твердой среды (5% агара) для получения отдельных колоний. 8.1.11.
Использование подвижности трепонем для получения их культур [24 — 26, 61 — 631 В центре соответствующей агаровой соеды (разд. 8.5.42), находящейся в чашке Петри нли в мензурке, вырезают углубление не менее 7 мм глубиною и 2 — 10 мм в диаметре (углубление не должно достигать дна). В это углубление вносят пробы, полученные из ротовой полости, кишечного содержимого или каловых масс. Крупные углубления (диаметр !0 мм) инокулиру ют 0,2 мл образца, а в небольшие углубления (днаметр 2 мм) пробу вносят косым уколом в нх стенку. Важно не допускать попадания проб на поверхность агара.
Сразу же после внесения проб чашки помещают в анаэростат (разд. 6.6.3) и инкубируют их от 4 до 7 дней при 37'С. В отличие от большинства других бактерий трепонемы могут мигрировать через агаровую среду. К ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР Там, где они растут, на некотором расстоянии от углублений наблюдается помутнение среды. Из периферической зоны помутневшей области отбирают часть выросшей культуры и переносят ее в соответствующую предварительно восстановленную полужидкую среду (например, бульон, содержащий 0,15% агара).
Поскольку можно ожидать присутствия нескольких видов трепонем, субкультуру рассевают по стенке вращающейся пробирки с предварительно восстановленной средой для получения отдельных колоний. Колонии образуют в среде мутные белесые плотные зоны. 8.1.12, Использование подвижности клеток Ярт([ипг оо1и1апз для получения их культур [30, 60! Для получения накопительной культуры гигантских микроаэрофильных бактерий 5. ио1и1алз готовят настой сена на стоячей прудовой воде.
После появления на поверхности настоя пены из-под нее отбирают пробы и исследуют их. Ищут очень крупные спириллы (1,4— мкм в диаметре и до 60 мкм в длину) с биполярно расположенными пучками жгутиков, которые хорошо видны при микроскопии в темном поле, Для получения накопительной культуры немного сенного настоя вносят в почвенную среду Прингсхейма (равд.
8.5.41) и инкубируют при комнатной температуре. Однако даже при такой процедуре накопления другие бактерии явно количественно превосходят 5. Оо1щааж 5, пойи1ааз выделяют также с помощью метода капиллярной трубки, впервые предложенного Гезбергером [60~. Размягчают на огне центральную часть стерильной стеклянной трубки (диаметр 5 мм), заткнутой ватными пробками. На размягченном участке трубку зажимают пинцетом с квадратными концами так, чтобы она почти полностью была пережата. Вновь нагревают уплощенную часть трубки и быстро вытягивают ее, чтобы образовался длинный (15 — 30 см) капилляр шириной О,! — 0,3 мм, имеющий овальное поперечное сечение. Концы капилляра запаивают на огне, а затем с помощью стерильного пинцета ломают капилляр у одного конца и втягивают в него на длину ог !О до 20 см стерильную почвенную среду Прингсхейма (супернатант).
После этого капил- ЧАСТЬ Н РОСТ ляр погружают в накопительную культуру и набирают в него еще 2 — 4 см этой культуры, убедившись, что между стерильной средой и культурой нет воздушного пространства. Кончик капилляра запаивают, оставляя небольшое воздушное пространство, и помещают капилляр на предметный столик микроскопа (100Х). В накопительной культуре 8.
ОО1и/апз часто способны двигаться быстрее, чем другие бактерии, и, следовательно, они быстрее достигают отдаленного конца капилляра, Как только спириллы достигнут этого конца, капилляр за ними ломают, переносят их в пробирку с полужидкой средой СН55 (равд. 8.5Л5) и инкубируюг при 30'С. Чистоту выделенной культуры проверяют с помощью фазово-контрастной микроскопии. 8.1.13. Использование скользящей подвижности Су/орйайа и Иех!Ьас1ег для получения их культур Разведенные пробы (из почвы, воды или помета животных, контактировавшего с почвой) рассевают на поверхности агаровой среды с низкой концентрацией питательных веществ, например с 0,1% тритона или триптиказы, либо с разведенным в 10 раз питательным агаром, В другом варианте пробы, представляю!цие собой измельченные листья наземных растений, водорослей или морских растений, размазывают по поверхности обедненного агара. Су1ор/!ада и Г/ех!Ьас/ег обладают способностью мигрировать по поверхности твердой среды.
Их можно обнаружить по появлению тонких и часто почти полупрозрачных колоний с пальцевидиыми выступами, которые разрастаются далеко за зону нанесения исходного материала. Из этих колоний получают субкультуру. Для подавления роста других бактерий часто оказывается полезным включение в агаровую среду пенициллина С! (15 ед /мл) и хлорамфеникола (5 мкг/мл) 1791, 8.1.14. Использование скользящей подвижности Вейп!а/оа для получения их культур [19, 84) Вепп(а1оа образует нити, состоящие из бесцветных клеток, Такие нити способны скользить по поверхности. депп!а1оа встречается в аэробных условиях в пресной 286 3 пОлучение нАкОпительных и чистых культуу или морской воде, богатой НЕЯ, причем она способна окислять сульфид в элементную серу, которая накапливается в клетках.
Для получения накопительных культур сначала готовят экстрагированное сено. Для этого сено измельчают и кипятят в больших объемах воды. В процессе экстракции воду трижды меняют. Вода в последней порции должна быть янтарного цвета. Сено подсушивают и помещают на подносе в термостат (37'С) для окончательного высушнвания.
Среду для получения накопительных культур, состоящую из 0,8%-ной суспензии высушенного экстрагированного сена в ?О мл водопроводной воды, вносят в ! 25-миллилнтровые колбы Эрленмейера н закрывают ватными пробками, Затем ее стерилизуют автоклавированием, добавляюг к ней 5 мл суспензни ила нз пруда, озера или ручья, содержащей гниющий растительный материал, и инкубируют при 25 'С в течение 10 дней. О процессе накопления бактерий свидетельствует появление резкого запаха Нз8 н образование белой пленки на поверхности среды и на стенках колб.
Г1ленку исследуют на наличие характерных нитей Ведйча1оа. Часть пленки смывают несколькими порциями стерильной водопроводной воды и затем наносят смывы на поверхность стерильной агаровой среды, содержащей 1% агара н 0,2% мясного экстракта. Пробы ннкубируют при температуре 28*С до тех пор, пока инги Всей(а1оа не начнут мигрировать к периферии агара на достаточное расстояние от других микроорганизмов. Агаровые блоки, содержащие единичные изолированные нити, вырезают и помещают на поверхность свежей агаровой среды.
После инкубацин вновь выделяют отдельные нити. Процедуру селекции повторяют до тех пор, пока культура не станет свободной от других бактерий. Проверка чистоты культур проводится путем посева в различные среды 8.1.15. Использование фильтруемости трепонем для получения их культур [27, 701 На поверхность агара в чашке Петри с соответствующей средой (разд. 8.5.42) помещают мембранный ультрафильтр с размером пор 0,15 мкм.
На фильтр кладут чАсть н. Рост кольцо диаметром 25 — 30 мм, слегка смазанное вакуумной смазкой. Затем на центральную часть мембранного фильтра наносят несколько капель разведенной пробы и инкубируют чашку в анаэростатс при 37'С в течение 1 — 2 нед. Трепонемы достаточно малы; они способны мигрировать через поры фильтра и проникать в расположенный под ним агар, где вызывают помутнение, Кольцо и мембранный фильтр снимают с поверхности агара, с помощью пастеровской пипетки удаляют поверхностный слой агара в области помутнения н микро- скопируют его в темном поле для выявления трепонем н контамннирующих форм. Методы субкультивирования и очистки культуры описаны в разд. 8.!.1!.
Подавлению роста сопутствующих бактерий часто способствует добавление в агаровую среду полимнксина В (800 ед./мл) и налидиксовой кислоты (800 ед.(мл). 8.1.16. Использование фильтруемости Сатру!ойас!ег )е!из для получения их культур (68, 69) 5 г фекальных масс или содержимого из кишечника крупного рогатого скота, овец, свиней нлн птиц разводят в 50 мл питательного бульона и фильтруют через несколько слоев марли, чтобы удалить крупные частицы. Используя в качсстве предварительного фильтра рыхлую стеклянную вату, пропускают фильтрат через мембранный ультрафнльтр с размером пор 0,65 мкм.
Обмакивают стерильный ватный тампон в фильтрат и густо рассекают его в чашках с агаром для бруцелл (разд. 8.5.!4). Чашки ннкубнруют прн 37'С в течение 4 — 5 дней в микроаэробиых условиях (5% Од, !0% СОТ и 85% 1(з). Подавлени1о роста других микроорганизмов способствует добавление в среду антибиотиков бацнтрацина (2 ед./мл) и новобиоцина (2 мкг(мл). 8.1.17. Использование фильтруемости Адиазр!г!!!ит йгас!!е для получения их культур [!2! На поверхность агара со средой для выделения (разд. 8.5.1) помещают мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм н наносят в центр этого фильтра 0,05 мл болотной или речяой воды.
Чашки инкубируют 1,5— 2 ч при комнатной температуре, затем снимают фильтр а пОлучение нАкОпительных и чистых культуР и продолжают инкубировать не менее 3 дней. Клетки А. Лгас((е имеют диаметр 0,2 — 0,3 мкм, т. е. они достаточно малы н способны проникать через поры ультра- фильтра в агар. В агаре находят полупрозрачные области роста и делают из них пересев. Другие бактерии, имеющие малые размеры (мелкие вибрионы, кокки нли короткие палочки), также способны проходить через ультрафильтры и образовывать колонии на поверхности :реды, но их легко отличить от находящихся под поверхностью агара типичных полупрозрачных колоний А. йтас1(е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
