Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Вероятно, это связано с их способностью накапливать в клетках в качестве запасного вещества поли р-оксибутират, если их предварительно выращивать на среде при лимитировании источниками углерода и энергии. Значение запаса поли р-оксибутирата для выживания клеток показано и для других бактерий [1б]. Поэтому истощение среды можно рассматривать как путь для выделения бактерий, образующих этот полимер.
8.2.20. Разбавленная среда для получения культур Бр/гаегоИиз [8] Бактерии рода ВрйаегоИиу, образующие чехлы, встречаются в ручьях, загрязненных сточными водами или органическими веществами; они формируют слизи. стые «пряди», прикрепленные к погруженным в воду предметам. Эти микроорганизмы можно также выделить из рек, открытых водостоков или канав, в которых нет явных признаков их присутствия. Процедура получения накопительных кульгур 5рлаегоИиу основана на их способности расти при низком содержании питательных веществ. К 50 мл среды для 5р/гаегоИиэ (равд. 8.5.46), налитой в квадратные бугыли Френча добавляют 25 мл пробы воды или по 1, 5 и 10 мл отстоя сточных вод или отстоя и:идкостей, полученных на раз- 306 ЧАСТЬ Н. РОСТ личных стадиях обработки сточных вод, Смесь инкубируют 5 дней при 22 — 25'С, Через 2 дня после начала инкубацин ежедневно с помощью микроскопа следят за появлением нитей.
Для получения чистой культуры собирают нити из накопительной культуры и рассевают их штрихом в чашках с твердой средой (0,057о мясного экстракта и 1,51)!1 агара). Инкубируют чашки 24 ч при 25'С и с помощью препаровальной лупы находят типичные извитые нити 5рйаегоИик. Переносят их в трнптнказо-глицериновый бульон !5 г триптиказы !ВВ). М1сго5!О!оцу Вуз1етз, Соскеузч)1!е, Мб.), 5 г глицерина и 1000 мл дистиллированной воды, рН 7,0 — 7,21 и инкубируют в нем до 2 нед, Через 2 — 3 дня Бр)1аегоИиз образуют толстую поверхностную пленку, бульон же под ней остается прозрачным.
Если в бульоне появляется помутнение, следовательно, он содержит другие микроорганизмы, но, даже если помутнения среды не происходит, для гарантирования чистоты следует вновь выделить ЯрлаегоИиз из поверхностной пленки путем рассева штрихом на агар, приготовленный на мясном экстракте.
Если хотят убелиться в том, что выделенные микроорганизмы имеют чехлы, помещают небольшой кусочек образующейся слизи на предмегное стекло в каплю воды, накрывают покровным стеклом и прижимают по- кровное стекло промокательной бумагой. На край по- кровного стекла помещают маленькую каплю 1%-ного кристаллического фиолетового, побы он просачивался в препарат по капиллярному принципу. Через 30 с промокают препарат бумагой, чтобы удалить избыток краски, н рассматривают его в микроскоп, используя иммерсионный объектив.
Клетки и чехлы должны быть хорошо видны. 8.2.21. Триптофаи как субстрат для псевдомонад 144! Для получения накопительных культур псевдомонад, способных использовать трнптофан как единственный источник углерода и азота, в 250-мнллилнтровую колбу Эрленмейера, содержащую 40 мл триптофановой среды (разд. 8.5.54), вносят около 0,1 г почвы, Смесь инкуби- а. получение нАкОПительных и чиСтЫх куЛьТуР руют на качалке в течение 5 — 7 дней при 25'С. 0,1 мл культуры переносят в другую колбу со средой и инкубируют 2 — 3 дня. После следующего серийного пересева полученную чистую культуру рассевают штрихом на триптофановую среду с агаром (!5 г/л).
После !в 3 дней инкубации делают посев из отдельных колоний на агаровые косяки. 8.2.22. )Л1, как субстрат для Агозр/ТШит и Аго1обас1ег Агозр1г(11ит — это микроаэрофильный азотфиксатор, ассоциированный с корнями различных растений; его находят также в почве [!7, 181. Отмытые кусочки корней длиною 5 — 8 мм, размягченные с помощью пинцета, помещают в безазотную полужидкую среду (среда Ы(Ь; равд, 8.5.37), Среду можно также инокулировать почвой. Не перемешивая, инкубируют 40 ч при 32'С и затем проверяют способность накопительной культуры восстанавливать ацетилен (тест на способность к азот- фиксации; равд. 20 2.7). Стараются не повредить плотную пленку под поверхностью среды, поскольку это может снизить активность ьнтрогеназы.
Если культура восстанавливает ацетилен, то продолжают проводить ее накопление с помощью пересевов на свежую среду 1ч(Ь С помощью микроскопа находят толстые, извнтые, подвижные палочки шириной около 1 мкм, заполненные гранулал1и поли-(!-Оксибутирата, и рассевают их штрихом в чашки со средой (ч(Ь, содержащей 1,5% агара и 20 мг дрожжевого экстракта на 1 л. Через педелю находят маленькие, белые, плотные колонии и переносят их на полужидкую среду Ы(Ь. Для окончательной очистки культуру из среды тч(Ь наносят штрихом на агар ВМ5 (разд. 8.5.10), где следят за образованием типичных розовых, часто складчатых колоний В отличие от Агоур/п//или который в условиях фиксации азота является облигатным аэрофилом, у Аго1О- бас1ег имеются механизмы защиты кислородочувствительной нитрогеназы от кислорода.
Поэтому Аго1обас1ег может фиксировать молекулярный азот в аэробных условиях. О,! г почвы вносят в однолитровую колбу со !00 мл лишенной азота среды для Аго1обас1ег (разд. 307 чАсть г!. РОСТ 8.5.3) и инкубнруют с перемешиванием при 30'С. Периодически культуру микроскопируют, чтобы выявить большие яйцеобразные клетки диаметром 2 мкм или более.
Получают вторичную накопительную культуру и очищают ее, делая пересев отдельных колоний на агаровую среду„лишенную соединений азота (среда для Аго1ОЬасГег с 1,5% агара). 8.2.23. Метанол как субстрат для гифомикробов 191 Представители рода Нурйопг(стоб(ит способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии такие одноуглеродные соединения, как метанол н метиламин.
К 5 мл воды из пруда или канавы либо 0,3 г ила или почвы (предпочтительно с низким содержанием органических веществ) в закрывающихся сосудах емкостью 75 — 125 мл добавляют нестерильную среду для Нур)!От!СТОЬгит (разд. 8.5.22), через кото. рую продувается молекулярный азот для создания анаэробных условий.
Сосуды доливают средой доверху н инкубируют в темноте при 30'С. Следят, чтобы сосуды оставались заполненными, добавляя в случае необходимости свежую среду. Обычно развитие гифомикробов происходит примерно в течение 8 дней. С помощью фазово-контрастной микроскопии находят палочкообразные клетки с заостренными концами овальной, яйцевидной или бобовидной формы, которые образуют нитчатые выросты (гифы) различной длины, способные ветвиться. Для вторичной накопителю!ой культуры используют свежую стерильную среду.
Чтобы выделигь отдельные колонии, клетки штрихом высевают на твердую среду (разд. 8.5.22) я япкубируют в аэробяых условиях. 8.2.24. Н, как субстрат для АдиаэрггИигп аиго(горЫсипг [7] Воду из эвтрофного озера фильтруют через мембранные фильтры, которые помещают на минеральную агаровую среду (разд. 8.5.30) в чашках, и инкубируюг ее при 30 "С в атмосфере следующего состава: 60% Нм 30% воздуха и 10% СОь Чистые культуры получают 308 а полхчянив накопительных и чистых кхльтхР повторным рассевом штрихом культур в чашки с минеральной агаровой средой.
Находят спириллы шириной 0,5 — 0,8 мкм со жгутиками на обоих концах клетки. Автотрофность в отношении водорода подтверждается тем, что в отсутствие органических веществ для роста культуры необходимо присутствие Н, и СО,. 8.2.25. Целлюлоза как субстрат длч цнтофаг Для получения накопительных культур цитофаг, разлагающих целлюлозу, иа поверхность основного минерального агара (равд. 8.5.6) помещают кусочки фильтровальной бумаги Ватман № 1.
На фнльтровальную бумагу кладут частицы почвы или растительного материала и инкубируют чашки при комнатной температуре. Следят за образованием вокруг частиц желтой, оранже. вой или розовой окраски, а также за процессом ливиса целлюлозы (бумаги). С помощью фазово-контрастной микроскопии можно обнаружить небольшие подвижные клетки цитофаг. Для выделения цитофаг, которые разлагают не только целлюлозу, культуру рассевают штрихом на агар с триптоном.
Отдельные колонии цитофаг, разлагающих только целлюлозу, получают в чашках, заполненных минеральной агаровой средой, содержащей густую суспензию тщательно измельченной целлюлозы (равд. 20.1.!3). Для предотвращения движения бактерий, имеющих жгутики, следует использовать достаточно твердую среду (0,85 — 1е)е агара), но не настолько, чтобы в ней нарушалась характерная для цитофаг скользящая подвижность. Иногда полезно тонким слоем агара с целлюлозой покрывать основную минеральную среду в чашках; при этом лучше видны зоны просветления, образующиеся в результате ливиса целлюлозы.
8.2.26. Агар как субстрат для Су1орпауа "(егтеп1апз и С, за1топ(со1ог (77) Морские микроорганизмы С. )егтеп1апз и С. за(топко1ог, являющиеся факультативными анаэробами, способны гидролизовать и сбраживать агар. Эту особенность используют для получения их накопительных 309 ЧАСТЬ 11.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
