Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 63
Текст из файла (страница 63)
рез11з можно получить, вырастив материал, по. лученный из бубонов и селезенки животных. 8.4. ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии 313 а. пОлучений ИАкопительных и чистых культуР могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений, Если микроорганизмы образуют слизь, то к ней часто прикрепляются посторонние формы.
В случае выделения штаммов ВасИиз или актиномицетов контаминирующие микроорганизмы могут быть опутаны цепочками клеток или соответственно гифами этих бактерий. Для очистки предпочтительнее использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Но даже на неселективной среде не следует очень быстро отбирать колонии, поскольку за данный отрезок времени могут еще не вырасти медленно растущие контамннирующие бактерии. Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при мнкроскопировании выявляются похожие клетки, в частности по размеру н окраске по Граму. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (Я) и шероховатые (Р).
Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковидные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Тем не менее указанные критерии широко используются при определении чистоты культур. 8.4 1. Посев штрихом или разливом на твердую среду Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами («штрихованные чашкиу), но лишь один из них (рис. 8.1) почти всегда дает хорошо изолированные колонии даже при отсутствии навыков у экспериментатора, Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках (подробности метода приведены в равд.
11.2.1). При работе с анаэробами «штрихованные чашки» нли чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежсприготовленные среды, и посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накоплення растворенного кислорода, 319 часть и. гост Рис. 8Л.
Удобный метод посева штрихом в чашки для получения отдельных колоний. гь Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяюшую дно иа 3 сектора. В. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности ага. ра а секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, н затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2 Прогревают петлю в плзмени н дают ей остыть.
Г. Проводят петлей по поверх. ности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3. ' Д. Инкубируют опрокинутые 1 вверх дном чашки, как показано на рисунке, для того чтобы конденсируюшаяся во. да с крышки не попала иа поверхность агара, В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в сек.
торах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолирован. ные колонии. Даже в таком случае необходимо какое-то время, чтобы удалить из сосуда кислород и создать там анаэробные условия. Однако если применяют метод вращающихся пробирок, содержащих предварительно восстановленные среды, то это не требуется !27 — 29!. Пробирки с предварительно восстановленной расплавлевной средой вращают таким образом, что агар затвердевает 320 а.
получение нАкОпительных и чистых культуР тонким слоем на их стенках. Метод посева штрихом во вращающуюся пробирку иллюстрирует рис. 8.2, Среду в такой пробирке инокулируют разведенной суспензией клеток и затем вращают пробирку для распределения клеток по поверхности агара (см. также равд.
6.6.4). 8.4.2. Последовательные разведения в твердой среде Самый простой способ посева с помощью разлива по чашкам заключается в том, что после инокуляции испытуемой пробы в пробирку со стерильным расплавленным агаром (охлаждеиным до 45 — 50'С) среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Однако, чтобы получить хорошо изолированные колонии, часто возникает необходимость разведения проб. Наилучшие результаты получают при использовании последовательных десятикратных разведений исходных проб. По ! мл каждого разведения вносят в чашки Петри, добавляют 15 — 20 мл расплавленной агаровой среды, смешивают, покачивая чашки несколько раз, и дают среде затвердеть.
При выделении анаэробов разведения смешивают с расплавленной, охлажденной и предварительно восстановленной средой во вращающихся пробирках непосредственно перед покрытием ею стенок пробирок. Недостатком разведения в расплавленной агаровой среде является то, что отдельные колонии оказываются погруженными в агар и поэтому извлечь их можно только механически — стерильным инструментом или отсасыванием с помощью пастеровской пипетки. Плохо также то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара (45 †50 'С).
Для выделения анаэробов, Особенно фототрофов и сульфатредуцирующих бактерий, часто используют метод глубинного посева со встряхиванием пробирок 1761. Для этого готовят серию стерильных пробирок, помещают их в водяную баню при 45'С и наполняют до половины расплавленной агаровой средой той же температуры. Ииокулируют первую из пробирок несколькими каплями смешанной культуры и осторожно размешивают со средой. Затем 1/1О объема среды переносят во вторую пробирку, В это время нижнюю часть первой 321 ЧАСТЬ 1! РОСТ Рис. 8.2. Посев во вращающиеся пробирки в аназробных условиях 1271. 7 — проволочная петля из платины или нержавеющей стали (нихром может вызынать окисление среды); 2— газовая канюля для постоянного продувания через пробирку газа, не содержащего кислород, 3 — предварительно восстановленная агаровая среда, покрывающая внутреннюю поверхность пробирки; 4 — соединяющийся с мотором держатель для вращения пробирки во время нанесения штриха.
Петлю с инокулятом опускают на дно пробирки, прижимают плоскость петли н поверхности агара и поднимают ее вверх. По. еле нанесения на агар штриха таким образом в нижней четверти пробирки плоскость петли ставят перпендикулярно поверх. ности агара (как показана на рисунке) и продолжают наносить штрих до верхней части пробирки. Удаляют газовую ка.
июлю, закрывают пробирку резиновой пробкой и инкубируют в вертикальном положении. пробирки погружают в вертикальном положении в холодную воду для затвердения агара. Размешивают содержимое второй пробирки и переносят 1/10 объема ее среды в третью пробирку, а вторую пробирку охлаждают. Таким же образом поступают с оставшимися пробирками. После этого в каждую пробирку с затвердевшим агаром наносят сантиметровый слой расплавленной стерильной смеси (1:1) парафина и вазелинового масла, благодаря чему среда предохраняется от контакта с воздухом. В процессе затвердения парафиновый К ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР слой может сжиматься, и тогда он перестает выполнять свою защитную функцию.
В этом случае следует применить слабое локальное нагревание, а также проколом удалить воздушные пузырьки из-под парафинового покрытия. Когда бактерии вырастают, выбирают пробирку с хорошо изолированными колониями и удаляют из нее столбик агара. Для этого вначале расплавляют и снимают парафиновый слой, а затем вводят между стенкой пробирки и агаром стерильную капиллярную пипетку.
Кончик пипетки опускают до дна пробирки и вдуванием воздуха выталкивают агаровый столбик из пробирки в стерильную чашку. Чтобы получить колонии, агар разрезают на кусочки. 8.4.3. Последовательное разведение в жидкой среде Этот метод применяют в том случае, если выделяемый микроорганизм не растет на твердой среде. При этом данный микроорганизм должен количественно преобладать в смешанной популяции. Готовят раствор смешанной культуры таким образом, чтобы при добавлении аликвот в большое число пробирок с питательной средой среднее число инокулнрованных бактерий было бы менее 0,05 на пробирку, Это достигается, например, при ииокуляции 1-миллилитровых аликвот в 100 пробирок нз 100 мл раствора, содержащего всего 5 бактерий.
При ннкубации в большинстве пробирок роста бактерий не происходит, но в те несколько пробирок, где наблюдается рост, вероятно, попала лишь одна бактерия (Р=0,975). Чем меньше среднее число бактерий, инокулнрованных в пробирку, тем больше вероятность того, что культура выросла из единственной бактериальной клетки. Следовательно, в большинстве инокулированных пробирок роста быть не должно, тогда в тех нескольких пробирках, где рост наблюдается, вероятность инокулирования среды единственной клеткой очень высока.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
