Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 81
Текст из файла (страница 81)
6. 0,5 мл самой легкой фракции клеток из центрифужной пробирки вносят в колбу с нагретой ростовой средой. $ йз й*„ 416 ЬЗ ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА 7. Тщательно измеряют оптическую плотность инокулированной среды, чтобы затем определять ее ступенчатое увеличение, свидетельствующее о синхронном росте культуры. Синхронность культуры поддерживается в течение двух или трех циклов деления клеток; в случае более длительного периода синхронность приходится устанавливать заново с помощью описанного выше метода. Проточное зональное центрифугирование в градиенте плотности позволяет получать большие количества инокулята для синхронизовапного культивирования микроорганизмов. Оно представляется перспективным в обеспечении «непрерывной» синхронизации с помощью рассчитанной во времени инокуляции турбидиметрически регулируемой проточной культуры (турбидостат).
На рис. 10.8 показана типичная кривая роста сиихронизованной популяции бактерий; видно, что после двух циклов кривая начинает выравниваться. 10.3.4. Периодическое и непрерывное культивирование с диализом (Ф. Герхардт) Диалнз представляет собой движимый концентрационным градиентом процесс разделения растворенных молекул за счет их различной диффузии через полупроницаемую мембрану, Этот процесс, применимый для роста и поддержания живых клеток, лежит в основе диффузионного метода культивирования.
Существуют и другие процессы, в которых используются мембраны, например злектроднализ, ультрафильтрация, микрофильтрация и обратный осмос. Однако для получения клеток и их мстаболитов лучше всего использовать именно диализ, поскольку в отличие от других методов при диализе происходит наименьшее засорение мембраны. При культивировании с диализом между культуральной камерой и сосудом с жидкостью помещают мембрану. Для повышения эффективности такого способа культивирования объем днализной жидкости должен быть значительно больше объема диализуемой культуры, или же диализную жидкость следует менять. 4!7 чАсть и. Рост Кроме того, мембраны должны иметь достаточную площадь, чтобы обеспечивалась удовлетворительная скорость диффузии.
Такая система культивирования с диализом может действовать 1п чита нли гп чйго в периодическом н непрерывном режимах или при их сочетании. Для культивирования с диалнзом используются мембраны трех типов, отличающиеся размером пор. Диализные мембраны имеют номинальный размер пор 1О нм. Они задерживают клетки и макромолекулы, но проницаемы для таких мелких молекул, как основные питательные компоненты, требующиеся бактериям для их ро. ста. Фильтруюи(ие мембраны (илн мембранные фильтры) имеют номинальный размер пор -100 нм; они тоже задерживают клетки, но пропускают макромолекулы со сравнительно низкомолекулярной массой. Днализные мембранные трубки различного размера получают из регенерированной целлюлозы путем вискозного процесса (()п)оп Сагб(де Согр.).
Имеются в продаже листы диализной мембраны с большим диапазоном пор, сделанные из различных материалов (бе!гпап Бс(епсез, 1пс., М1111- роге Согр., (Чпс!ероге Согр.). Для бактериологических целей следует принимать во внимание такие факторы, как автоклавируемость мембран, размер их пор, химическая инертность и проницаемость (которая в свою очередь определяется пористостью, емкостью и толщиной мембраны). Мембраны третьего типа, через которые проходят растворенные вещества, не имеют пор и проницаемы для газов, поскольку газы растворимы в мембранном материале, например в резине или поликарбонате. Для разделения культуры н диализата может использоваться также поверхность раздела двух физически различных фаз (интерфазная днализная культура), например в твердо-жидкой двухфазной системе (равд.
9.2.2). К специфическим преимуществам использования диализа при культивировании бактерий относятся: 1) удлинение экспоненциальной фазы роста в периодической культуре, что позволяет получать высокие плотности живых клеток; 2) увеличение стационарной фазы роста культур, что позволяет увеличить выход метаболитов, связанных с этой фазой; 3) ослабление контроля путем ингибирования продуктом за счет удаления или 418 1к жидкАя культуРА разведения продуктов метаболизма, что увеличивает их образование в периодической или непрерывной культуре; 4) установление состояния равновесия с высоким уровнем метаболизма, что позволяет иммобилизовать клетки для длительного образования определенных продуктов; 5) получение метаболитов, свободных от клеток, и, наоборот, клеток, свободных от макромолекул среды; 6) возможность изучения клеточной популяции |п з)(п или при создании 1п у1уо искусственной среды, например в природной экологической обстановке или в организме животного; ?) возможность изучения взаимодействия между популяциями клеток.
История диализной культуры восходит к 1896 г., когда Мечников провел свои опыты с холерными вибрионами. Чтобы изучить способность вибрионов продуцировать растворимый токсин, он помещал их в коллодиевом мешочке в брюшную полость живой морской свинки. История вопроса, общие принципы, математическая теория и практическое применение диализной культуры приведены в исчерпывающем обзоре Шульца и Герхардта !511.
Опубликован 1?) обзор использования принципа диализной культуры иммобилизованных клеток, применяемых в качестве ферментных препаратов (равд. !0.3.5), а в докторской диссертации Стайбера (Университет штата Мичиган, Ист Лансинг, 19?9) собраны последние данные по рассматриваемому вопросу. Систе,иы !п и!уо Термин «диффузиониая камера» часто используют для описания небольшой диализной культуральной системы, которую имплантируют подопытному животному (например, в брюшину, рубец или под кожу). Она представляет собой пластмассовый цилиндр, закрытый с обоих концов мембранными фильтрами.
Из такого цилиндра (типа барабана) можно отбирать пробы. Введенные в жидкую среду внутри цилиндра бактерии растут исключительно за счет диффузии питательных компонентов хозяина. Такие системы используют в бактериологии для изучения иммуиных реакций и роста плохо культивируемых патогенов типа Мусобас!ег!ат 1ергае, Тгеропета ра1Ыит и о'еизегга уопоггйоеае. ЧАСТЬ П.
РОСТ Система! ех ч1чо К системам ех м(чо относится, например, следующая. У крупных подопытных животных (допустим, коз) хирургически обнажают сосудистый пучок на шее, выводят наружу и обеспечивают его контакт с диализным мешком, внутри которого содержится бактериальная культура. Такая культуральная диализная система ех н)чо позволяет бактериям расти исключительно за счет питательных компонентов крови, причем в культуре отсутствуют макромолекулярные и клеточные защитные механизмы (если используются соответствующие диализные мембраны).
В одной из таких систем бактерии находятся в обычном лабораторном ферментере и культура постоянно циркулирует, например через рубашку (с волокнами) для искусственного почечного гемодиализа, которая соединяется трубкой с артерией экспериментального животного 1501. В другой системе бактерии помещают в небольшую (3 мл) камеру из прозрачной пластмассы (поликарбоната), закрытую мембраной, по другую сторону от которой может протекать кровь. Все устройство укрепляют на шее свободно передвигающегося животного. Такая система неприменима для облигатных аназробов, но она успешно используется для многих факультативных аназробов, и се можно применить для изучения реакций между паразитом (специфическим патогеном) и хозяином [261.
Системы ш чйто При культивировании с диализом в лабораторных условиях мембранную диализную трубку с культурой помещают в пробирку, колбу или бутыль со средой, причем ее сгибают таким образом, что она образует полость с двойными стенками, между которыми находится культура (рис. 10.9). В устройстве, основную часть которого составляет стеклянная трубка из пирекса с загнутыми краями (рис. 10.10), сочетаются преимущества встряхиваемых колб (равд. !0.1.2) и диализной культуры. В подобных устройствах 1511 можно использовать любые типы листовых мембран. 420 и. жидкая кнльттпл 5-) ( Рис, 10.9.
Система для культивирования бактерий в диализном мешке. Трубка диализной мембраны свернута таким образом, что образует мешок с двойными стенками (3), в наружных полостях которого содержится культура (2). Среда (1) помещена в оплетенную бутыль. Имеются также трубка для инокуляпии и внесения проб (5) н сифон для отбора культуры (4) (53). Рис.
10.10. Сосуд для диализиой культуры, оборудованный удерживающим устройством для крепления на круговой качалке. Йижняя часть сосуда заполнена стерильной средой, которая перемешивается вращающимся шариком. В верхней части находится культура, котаран турбулентно аэрируется за счет перемешивания в присутствии о~бойника (251. Прн осуществлении культивирования с диализом в лабораторных или производственных масштабах целесообразно выращивать бактерии в отдельной замкнутой системе, которая соединялась бы с диалнзной замкнутой системой промежуточным диализатором [22!.
Такое устройство «диализатор — диализная культура», схематически представленное на рис. 1О.!1, может работать в периодическом режиме в обеих замкнутых системах 421 ЧАСТЬ Н РОСТ Г,5„ 0 О Г„,зг Б Г1,5, Х 5г Г 5О Рнс 10ЛК Схемы четырех моделей диализного культивирования. Принципы изображенной системы диализатор — дизлизнзя культура пригодны для многих целей. Обозначения Р— скорость потока, Б— концентрация субстрата, У вЂ” объем, Х вЂ” концентрация клеток, посту. пзюпзих в резервуар и ферментер, а также их концентрация в этих сосудах и в вытекзюпгей из них среде. Воспроизводится с некоторыми изменениями из работы (51) А. Резервуар и ферментер для периодического культивирования.
Б. Резервуар и фермеитер для непрерывного культивирования. В. Резервуар для периодического культивирования и ферментер для непрерывного культивирования. Г. Резервуар для непрерывного культивирования и фермеитер для периодического культивирования. (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
