Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 84
Текст из файла (страница 84)
Например, в условиях лимитирования энергетическим субстратом и довольно быстрой скорости роста выход клеток составляет примерно 10-~-2 г сухой биомассы на 1 моль синтезируемого АТР. Однако выход биомассы в пересчете на 1 моль АТР довольно широко варьирует для разных бактерий, если рост не лимитируется энергетическим субстратом, а скорость роста культуры значительно ниже максимальной. Источники углерода и энергии могут использоваться не только для роста клеток, но и для образования продукта.
Кроме того, энергетические субстраты расходуются на поддержание жизнеспособности клеток. Поскольку клетки могут использовать энергетические субстраты для дыхания в отсутствие роста, энергетические затраты на поддержание жизнеспособности бактерий будут вносить свой вклад в потребление этих субстратов без сопутствующего увеличения биомассы. Эндогенный метаболизм практически не оказывает влияния на расчеты выхода клеток, если скорость роста культуры близка к максимальной и энергетический субстрат является лимитирующим питательным компонентом.
Однако потребление энергетических субстратов для поддержания жизнеспособности клеток может значительно возрасти при скоростях роста ниже максимальной или в экстремальных биофизических условиях среды. Поскольку надежные расчеты выхода биомассы требуют осторожного и тщательного контроля условий культивирования, лучше всего их проводить для хемостатных систем. Именно в этих условиях лимитирующий рост субстрат н удельная скорость роста 1х могут регулироваться. Расчет общего выхода биомассы на основании данных, полученных в проточной культуре, предполагает, ЧАСТЫ!.
РОСТ что концентрации субстрата и клеток находятся в состоянии равновесия. Поэтому легче всего такой расчет провести для культуры, выращиваемой в хемостате. В хемостатной среде скорость роста бактерий лимитируется только одним питательным компонентом. Все остальные питательные компоненты добавляются в избытке. Для составления такой среды следует провести элементный анализ бактерий, которые будут культивироваться в хемостате. В среду добавляют все компоненты клетки, обнаруженные при таком анализе. В конечном счете рост определяется концентрацией лимитирующего питательного компонента.
Поскольку концентрация клеток в хемостате регулируется автоматически в соответствии со скоростью добавления к среде лимитирующего питательного компонента, более важно отношение компонентов среды, а не их абсолютные количества. Поэтому для определения общего выхода биомассы среду следует составлять так, чтобы отношение элементов, поставляемых в среду, к элементам, являющимся лимитирующими, было значительно выше, чем отношение, вычисленное на основании данных элементного анализа. Приводимые ниже расчеты основаны на том, что в отношении концентрации клеток и концентрации субстрата система находится в состоянии равновесия. За этим следят в течение периода времени, достаточного для замены одного объема среды в ферментере.
Если условия культивирования начинают изменяться (увеличивается или уменьшается скорость подачи среды в хемостат), то оператор должен иметь достаточно времени для возвращения культуры в состояние равновесия. Этого достигают путем смены не менее четырех объемов жидкости в ферментере. Поскольку проточный ферментер работает по принципу разбавления, ступенчатое нли импульсное изменение условий работы ферментера может вызвать отклонения от существующего состояния равновесия. В результате система будет стремиться к новому состоянию равновесия со скоростью, определяемой скоростью разбавления культуры.
Иными словами, для завершения перехода культуры к новому равновесному состоянию необходимы четыре цикла. Например, 2-литровый хемостат, в котором скорость поступления и удаления среды равна 0,5 л/ч, работает со скоростью раз- Ю. ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА бавления Р/)г=/)=0,25 ч-'. Время, необходимое для четырех обновлений объема среды, рассчитывается путем деления 4 на скорость разбавления. В данном случае объем среды в ферментере будет полностью обновлен 4 раза за 16 ч (4/0,25 ч-'), т.
е. после изменения условий роста проточной культуры и до установления нового равновесия должно пройти не менее 16 ч, В действительности время, необходимое для достижения нового состояния равновесия, может зависеть от способа изменений условий культивирования. Если такие изменения заключаются, например, в ступенчатом снижении поступления питательных компонентов, то достаточно четырех циклов. Если же эти изменения включают в себя увеличение поступления питательных компонентов в условиях быстрого роста культуры, то для достижения нового равновесия будет необходимо более четырех циклов. В этом случае для быстрорастущих клеток могут понадобиться новые ферменты, осуществляющие метаболизм добавляемых питательных компонентов. После достижения состояния равновесия при проточном культивировании общий выход биомассы можно определить следующим образом: у (Х Хе) Сухой вес клеток, г (ое — д) Поглощенный субстрат, г где Х вЂ” сухой вес клеток (в граммах) на 1 л вытекае.
мой нз ферментера среды, Хо — сухой вес клеток (в граммах) на 1 л среды„подаваемой в ферментер (обычно нуль), 5 — вес субстрата (в граммах) на 1 л вытекаемой среды и Яо — вес субстрата (в граммах) на 1 л среды, подаваемой в ферментер. Если в ферментер подается стерильная среда, то величина Хо равна нулю и выход становится равным Ухг =Х/(5а — 5). Для определения сухого веса клеток путем количественного фильтрования через предварительно взвешенный мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм пропускают тщательно отмеренный объем культуры из ферментера. Клеточный осадок на фильтре отмывают буфером нли дистиллированной водой, чтобы удалить остатки среды.
Мембранный фильтр высушивают до постоянного веса в термостате с температурой не выше 105'С. 43б ЧАСТЬ П РОСТ Чтобы избежать излишнего подсушивания клеток, которое приводит к потере веса, температуру термостата можно снизить. Предостережение: многие фильтры после отмывки и высушивания теряют свой вес. Поэтому следует всегда фильтровать и взвешивать несколько проб, а также промывать и взвешивать несколько фильтров в качестве контроля. Более точный метод заключается в центрифугировании и отмывке клеток, как описано выше (равд.
10.4.2). При этом отбирают большие объемы среды, ресуспендируют клетки в небольшом объеме воды, высушивают и взвешивают (разд. 25,2.2). Общий выход биомассы связан с потребностями в лимитирующихх субстр атах для поддержания жизнеспособности клеток и их роста, причем субстраты выступают в роли источника энергии согласно следующему уравнению: где 1А — удельная скорость роста (ч-'), т — удельная скорость потребления субстрата для поддержания жизнеспособности клеток (ч '), У„ы — общий выход клеток и УΠ— удельный выход роста. Величины и и Уо можно определить, построив на миллиметровой бумаге график зависимости 1/У„!, от 1/1! (напомним, что для простой проточной культуры без рециклизации клеток 1!=Й).
Если данная зависимость имеет вид прямой линии, то эта линия пересекает ось ординат в точке 1/Уш а ее наклон соответствует величине т. Хотя выход биомассы удобно выражать в виде биомассы в пересчете на массу или количество молей использованного субстрата, при этом иногда возможна путаница. Херберт 1301 предложил выражать выход биомассы в грамм-атомах углерода выросших клеток в пересчете на грамм-атомы элемента, поглощенного из лимитирующего субстрата. Принятие этого определения поможет стандартизировать приводимые в литературе методы и устранить болыпую часть неясностей при интерпретации полученных данных. При выражении интенсивности роста в грамм-атомах углерода образованных клеток нет необходимости определят! их полный эле- ЖИДКАЯ КУЛЬТУР." 1а Осеан а пенне и Определенне Коэффициент общего выхода биомассы (общий экономический коэффициент), У ы равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу потребленного питательного субстрата (в граммах) малярный коэффициент выхода; У 7 равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу потребленного питательного субстрата (в молях) Теоретический или максимальный коэффициент выхода; Уннх равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу потребленного питательного субстрата (в граммах) Удельный коэффициент выхода; Уе равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу питательного субстрата (в граммах), потребленного для образования клеток Коэффициент общего выхода биомассы У го, равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу потребленного кислорода (в молях) Коэффициент общего выхода биомассы, Уантр равен отношению веса образованного химического продукта (в граммах) к весу образованного АТР (в молях) Коэффициент общего выхода продукта; Унан равен отношению веса образованного химического продукта (в граммах) к весу потребленного субстрата (в граммах) Удельный коэффициент выхода продукта; Урн равен отношению веса синтезированного продукта (в граммах) к весу образованных клеток (в граммах) Теоретический или максимальный коэффициент выхода продукта; Ураны*ха равен отношению веса продукта (в граммах) к весу субстрата, превращенного в продукт (в граммах) У„„, У„У Уг У,~онеахн Улгах Уа У„о,, Уо, У,гетр, Унте Ун Унга Уаы(мнх) Уранах) 437 Таблица 10.5.
Термины, используемые при расчетах выхода биомассы ЧАСТЬ 11. РОСТ Продолжение табл. 10.5 Определение Обозначение е Удельная скорость роста [отношенне веса образованных за 1 ч клеток (в граммах) к общему весу клеток (в граммах)) Коэффициент поддержания (отношение веса потребленного за 1 ч субстрата (в граммах) к общему весу клеток (з граммах)1 а Символ, обозначенный первым, используется чаще.
ментный состав; достаточно только определить содержание углерода, В табл. 10.6 суммированы термины, используемые при расчетах выхода биомассы. 10.6. ФИРМЫ-ИЗГОТОВИТЕЛИ 1. Аагоп Ецп!ршеп! Со,, Онс Агесо 1пс., 9301 %. Вегп1се 5!ч бсьп1- !ег Раук,! 1. 60176 2. А1г Кезонгсез, 1пс,, 800 Е. 1(ог(Изчез! Н!кьтчау, Ра1анпе, 1ь 60067 3. Адоу Сгайз Со., бпьз!6)агу о1 сох ЕЧп!ршеп! Со., КК Вох 2С-А, Ое)рий Нч) 46923 4. Агпзап ! пдпшыез, !пс., 73 Ропе) 51., 'зуапьаш, МА 02154 5. В. Вганп Ме!знпдеп АО, Р.О.В. 346, О-3508 Ме)зппнеп, чНез! Сегптапу б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
