Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 88
Текст из файла (страница 88)
Ряд авторов рекомендует вести подсчет при многократном заполнении камеры, с тем чтобы усреднять получаемые при этом результаты, При использовании описываемого здесь метода в этом нет необходимости, поскольку каждый раз измеряется толщина заполненного пространства камеры. Лучше подсчитывать количество клеток в определенных квадратах, например в четырех угловых, и в квадратах, расположенных по диагонали. Это позволяет избежать подсчета одного квадрата дважды, а также усреднить возможный геометрический градиент клеток в камере. 8.
Число клеток определяют по следующей формуле: Общее число подсчитанных клеток Фактор разведения 4 10' Число подсчитанных малых квадратов Толщина камеры (мкм)' Если точно расположить покровное стекло, то объем раствора над малым квадратом равен 50 50 20 мкм'= =5 10' мкм'=5 1О а мл. Обратная этому числу цифра 2 10Т/мл представляет собой обычный фактор в формуле, предлагаемой в инструкциях фирм — изготовителей камер. Приводимая выше формула уменьшается до этой величины, если толщина камеры равна 20 мкм. Чтобы процедура оказалась успешной, необходимо, чтобы при измерении толщины камеры к каждой поверхности было прикреплено по крайней мере несколько клеток.
Удобнее, однако, производить подсчет, когда основная масса клеток прикреплена к одной поверхности. Для завершения счета в малом квадрате следует сфокусировать объектив на свободных клетках, а затем на поверхности раздела, где расположено меньшее число клеток. Подсчитав об- 453 часты!. Рост щее число клеток в квадрате, заново фокусируют объектив на исходной поверхности и затем передвигают камеру. 11 1,2. Электронный подсчет Счетчик клеток типа Соп((ег Сопи(ег (Соп11ег Е!ес1гоп(сз, Н1а1еап, Г!а.), его аналоги, производимые другими фирмами, а также аналогичные приборы, создаваемые в лабораториях, в последние 25 лет оказали значительное влияние на развитие бактериологии. Такие приборы давно и широко используются в клинической гематологии.
Они весьма удобны для подсчета клеток простейших и немицелиальных дрожжей, но непригодны для мицелиальпых организмов. Хотя применение таких счетчиков привело к созданию новых концепций в бактериологии, их использование в случае мелких палочкообразных бактерий крайне затруднительно. При участии физиков и инженеров проводятся исследовательские работы с целью улучшения электронного метода подсчета и повышения его надежности.
О реальных трудностях, с которыми столкнулись при использовании метода, свидетельствует, например, тот факт, что исследователи. принимавшие участие в его разработке, больше не пользуются им. В настоящем руководстве мы обсудим лишь принципы метода, основные трудности при работе'е-ним и пути их преодоления. По остальным вопросам мы отсылаем читателя к опубликованным работам.
После этого читатель сам сможет сделать вывод о применимости метода электронного подсчета для решения различных задач в бактериологии. Принцип электронного подсчета заключается в следующем. Разбавленная бактериальная суспензия подается через очень маленькое отверстие (жиклер), соединяющее две камеры с жидкостью.
В каждой камере с помощью электродов измеряется электрическое сопротивление. Несмотря на то что электропроводность среды достаточно велика, размер жиклера настолько мал, что электрическое сопротивление в нем несоизмеримо выше, чем в остальном объеме. Когда частица переносится с жидкостью через жиклер, сопротивление возрастает еще сильнее, поскольку элсктропроводность бактерий ниже, 11. ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА чем среды.
Зти изменения сопротивления улавливаются с помощью измерительной цепи и превращаются в импульс напряжения или силы тока. Подсчет импульсов в электронной цепи подобен подсчету радиоактивности, причем очень слабые импульсы элиминируются (отсекаются) с помощью дискриминатора. Слишком сильные импульсы могут быть отсечены с помощью второго дискриминатора («верхнего уровня»), если предполагают, что они имеют своим источником частички грязи или другие примеси. В усовершенствованных счетчиках импульсы анализируются по их величине и запоминаются в многоканальном анализаторе.
При необходимости эти данные извлекаются из памяти и переносятся на гистограмму, где можно определить число частиц, их среднюю величину и среднеквадратичное отклонение. Все данные рассматриваются в совокупности, и в ходе анализа дискримииируются очень сильные или очень слабые импульсы, Подобные приборы требуют в процессе подсчета принудительной подачи точно измеренных объемов жидкости через жиклер.
Обычно это достигается за счет вытеснения жидкости, находящейся в контакте с ртутным столбиком; при этом ток эффективно проходит через ртуть, но не через поступающую среду. При использовании электронного метода подсчета сталкиваются с тремя важными проблемами. Первая из них заключается в том, что, поскольку некоторые бактерии очень малы (меиьше 0,4 мкм'), импульсы сопротивления, возникающие при их прохождении через жиклер, сравнимы с величиной «шума» (фона), образующегося из-за турбулентности проходящей через жиклер жидкости. Можно установить дискриминирующее устройство, «срезающее» турбулентные шумы, однако при этом не исключена потеря некоторой информации об истинном числе клеток, особенно в случае присутствия только что разделившихся клеток, Другой способ учета турбулентных шумов состоит в измерении «шумов» контрольных (не содержащих клеток) проб и вычитании их из измеряемых импульсов.
Однако хорошо известно, что пробы, не содержащие клеток, значительно отличаются друг от друга по импульсам сопротивления. К тому же турбулентность в потоке жидкости устанавливается сама по себе, сохраняется некоторое время, а затем меняется. 455 ЧАСТЬ 11. РОСТ Наконец, вероятность общей ошибки возрастает, если контрольные пробы обладают статистически значимыми различиями (разд. 11.5.5). Не возникает проблем лишь при работе с определенными бактериями, растущими на богатой среде, где даже вновь образованная клетка дает импульс больший, чем турбулентный шум, или при работе с крупными бактериями типа АаогоЬас1ег ап111з, клетки которых в несколько раз крупнее клеток Е. со(1.
Вторая проблема заключается в том, что после деления дочерние клетки не всегда в достаточной степени отделяются друг от друга. Эту проблему, а также проблему, связанную с тенденцией к образованию нитевидных клеток, можно исключить, если правильно подобрать микроорганизм и условия его роста. Совершенно очевидно, что выбор Е. сой для физиологических и генетических исследований в значительной мере был обусловлен низкой способностью клеток этого организма к агрегации, сцеплению дочерних клеток между собой, образованию цепочек и нитей.
Для диспергирования агрегатов, отделения разделившихся дочерних клеток и фрагментирования нитей используют интенсивное перемешивание в миксере типа 1гог1ех или мягкую ультразвуковую обработку. Следует, однако, отметить следующее: для доказательства того, что все частицы представляют собой отдельные клетки, а разрушение клеток незначительно, счетчик типа Соп!1ег Сонп1ег отнюдь не лучше, чем микроскопия с масляной иммерсией. Существует также связанная с предыдущей проблема (разд. 11.5.5) совместного прохождения через жиклср более чем одной частицы в течение короткого времени, достаточного для того, чтобы электронное устройство зарегистрировало прохождение более чем одной крупной частицы.
Ее можно решить, используя различные разведения суспензии, поскольку, чем больше разведение, тем меньше вероятность совместного прохождения (см. ниже). Особенно важно эту проблему учитывать при изучении распределения клеток по размерам.
Третьей важной проблемой, возникающей при работе с электронными счетчиками, является засорение жиклера. Если увеличить его диаметр, то изменение сопротивления при прохождении частицы составит лишь незначительную часть общего сопротивления. Поэтому для под- измегенив РОстА счета мелких палочковидных бактерий типа Е.
сой диаметр жиклера должен быть не больше 12 — 30 мкм. Видимо, за выбор подходящего жиклера, который позволяет достаточно сильно увеличивать сигнал, приходится расплачиваться повышенным шумом и мириться с возможностью засорения жиклера. Одним из способов борьбы с засорениями является ультрафильтрация всех растворов. Можно также дать отстояться растворам в течение долгого времени в бутылях с сифоном и затем слить растворы, лишенные частиц.
Важную роль играет выбор растворителя, не способствующего образованию частиц, например, Кубичек 1381 рекомендует использовать 0,1 н. НС!. НС! обладает хорошей летучестью и не выщелачивает из стекла вещества, которые в дальнейшем могут образовывать осадки. Однако на практике проблема засорения решается далеко не просто, причем при использовании модификаций методов, разработанных для точного определения размеров клеток, она усугубляется. Введение в практику электронного счетчика системы Соп!1ег Сопп1ег оказало влияние на изучение роста бактерий, причем главным образом благодаря принципиальной возможности измерять распределение клеток по размерам и в меньшей степени возможности подсчета клеток.
На практике крайне сложно точно измерить размер клетки из-за импульсной природы сопротивления, генерируемого проходящей через жиклер частицей. Были предприняты попытки преодолеть эту трудность, используя сравнительно длинные (100 мкм) поры 1371. Хотя при этом снимаются некоторые физические огра. ничения, с замедлением потока жидкости в длинной поре увеличивается возможность засорения. В другом подходе используется специальное гидродинамическое фокусирование растворов, обеспечивающее движение бактериальных клеток очень близко к центральной оси поры и окружение их жидкостью, не содержащей частиц 150, 52, 55!. Дополнительную информацию об этом методе можно найти в работах 12, 17, 381, а также в инструкциях, прилагаемых к приборам фирмами-изготовителями. 457 чАсть н, Рост 11.2.
ПОДСЧЕТ КОЛОНИР( По существу бактериология превратилась в экспериментальную науку начиная с того момента, когда Роберт Кох по совету Фанни Хессе впервые в лабораторной практике использовал чашки с агаровой средой. Это позволило не только осуществлять клонирование чистых культур, но также подсчитывать количество колоний, образующихся из отдельных «жизнеспособных клеток». Существует много вариантов этого метода.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
