Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 86
Текст из файла (страница 86)
При достижении сбалансированного роста и при условии постоянства среды культура будет оставаться в этом состоянии бесконечно долго (если не изменится в результате мутаций или селекции). Однако это только теория. Практически невозможно измерить все параметры культуры, даже если она поддерживается в состоянии непрерывного разведения. Однако если использовать менее жесткие критерии, то культуры, находящиеся в состоянии сбалансированного роста, изучать довольно просто. Рассмотрим культуру в состоянии сбалансированного роста. Обозначим какое-нибудь экстенсивное свойство, например биомассу, ДНК, РНК или площадь поверхности клеток в пересчете на миллилитр культуры, бук. вой Х. Скорость увеличения Х пропорциональна количеству биомассы, и, следовательно, — =АХ, «Х вт где Х вЂ” коэффициент пропорциональности.
После интегрирования и подстановки граничных условий (Х=Хо, когда Т=О) получаем Х = Х,вх'. 443 ЧАСТЬ Н. РОСТ Иными словами, для каждого вещества увеличение Х происходит экспоненциально во времени. Если соотношение между двумя веществами остается постоянным, тот же самый коэффициент пропорциональности следует использовать при любом выборе параметра Х. Коэффициент )ч называют удельной скоростью роста.
Экспоненциальное увеличение в соответствии с одной и той же удельной скоростью роста характерно не только для любого вещества, обозначенного Х, но и для любой комбинации веществ или скорости обмена любого вещества. Это позволяет использовать в качестве показателя рос1а потребление кислорода или образование метаболита. Такие интенсивные свойства, как Х и отношение концентраций различных субстратов в условиях сбалансированного роста, остаются постоянными. Кроме того, остается постоянным распределение клеток по размерам.
При этом в нормальной клетке все внутрнклеточные про. цессы идут с постоянными скоросгями, остается также постоянной способность каждой вновь образованной дочерней клетки к образованию колонии (т. е. не изменяется доля нежизнеспособных клеток). Поэтому в данных специфических условиях независимо от способа измере ния роста (подсчет частиц, образование колоний или хи мическое определение клеточных компонентов) получают одинаковую удельную скорость роста, которая не меняется со временем. В принципе такие «идеальныеь условия можно создать лишь при непрерывном культивировании в проточном режиме, Сбалансированный рост достигается за счет роста, ограниченного скоростью добавления питательных компонентов в условиях хемостата, а также за счет неограниченного роста в условиях турбидостата, где культура механически разбавляется для сохранения постоянного количества биомассы в единице объема среды.
Сбалансированный рост бактерий получают также при повторяющемся разбавлении периодической культуры ~39, 49]. Изменения в клетках при различных скоростях роста Организмы отвечают на изменения химических и физических условий среды изменением собственного соста- И ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА ва. Эти изменения четко продемонстрированы для некоторых энтеробактерий 131, 39], но они характерны вообще для всех чрокариот. В принципе благоприятные условия способствуют быстрому росту, который требует более высоких концентраций рибосом и связанных с ними белков. В терминах состава клеток это означает более высокое содержание РНК.
Кроме того, при благоприятных условиях роста клетки могут накапливать резервный материал, например гликоген и поли+оксимасляную кислоту, а также увеличиваться в размерах. Как предполагают, последнее связано с тем, что клетки в таких условиях не нуждаются в увеличении относительной поверхности, облегчающем использование субстратов в разбавленных средах.
Из-за изменений в составе клеток при измерении роста по содержанию клеточных компонентов возможны ошибки. Строго говоря, подобные измерения можно проводить лишь при росте в одной и той же среде и при условии, что сами бактерии не изменяют ее состав. Несбалансированный рост В ходе развития стационарных культур, в особенности при разведении таких культур свежей средой, происходят значительные изменения свойств микроорганизмов. Как уже упоминалось, это было продемонстрировано для некоторых энтеробактерий [1, 11], но, вероятно, относится и ко всем прокариотам. В некотором смысле стадии развития стационарной культуры являются артефактом, зависящим от состава среды, а также возраста и состояния клеток инокулята; однако во всех случаях эти стадии существенны при измерениях роста. Феномены, проявляющиеся на различных стадиях развития стационарной культуры, важны в экологических исследованиях, где особую роль играют условия окружающей среды, которые в значительной степени неконтролируемы.
Ответ культуры на колебания естественных условий включает в себя также изменения клеточных характеристик 131, 34]. Так, например, при разведении стационарной культуры, растущей в богатой среде, происходит ускорение макромолекулярного синтеза. Вначале синтезируются компоненты системы биосинтеза белка — рибо- 445 ЧАСТЪ 11 РОСТ сомные белки и рибосомная РНК. И только после завершения синтеза ряда макромолекул происходит клеточное деление. В этой фазе значительно возрастает средний размер клеток.
Когда среда уже не способна поддерживать быстрый рост бактерий, интенсивность клеточных процессов замедляется, что приводит к образованию мелких клеток с недостаточным содержанием РНК. Наконец, часть бактерий гибнет, т. е. происходит уменьшение числа колониеобразующих единиц ~161 Вероятно, большинство исследователей, предполагающих применять приведенные в этом руководстве методы, будут вызывать изменения роста преднамеренно. Такие изменения можно вызвать колебаниями в содержании или недостатком питательных компонентов в среде,добавлением ингибиторов роста (особенно антибиотиков),ионизнрующим излучением и другими экстремальными физическими факторами, например высокой или низкой температурой и осмотическим давлением.
Поскольку влияние перечисленных факторов на рост может быть довольно сложным, при интерпретации результатов нужно быть очень осторожными. Источники ошибок Существуют четыре вида источников ошибок. Первый н наиболее опасный из них заключается в том, что бактерии, которые обычно делятся регулярно, в условиях слабой токсичности способны расти с образованием скоплений и нитей. Второй опасный момент связан с различной степенью жизнеспособности поврежденных бактерий при различных условиях культивирования. Восстановлению жизнеспособности бактерий способствуют процессы репарации, но они протекают лишь в определенных условиях [8~. Третий источник ошибок связан с возможным образованием резистентных форм.
Учет бактерий, способных к образованию спор, не составляет проблемы, поскольку известны методы контроля и измерения, позволяющие вносить соответствующие поправки. В том случае, когда споры в растущих споро- образующих культурах не появляются, возможны ошибки при измерении роста. Четвертый источник ошибок имеет отношение к процедурам, с помощью которых !! НЗМВРВНИВ РОСТА инокулят вводят в новую среду. Результаты зависят от того, как увеличивается при введении концентрация инокулята — постепенно или ступенчато, насколько долго инокулят присутствует в высокой концентрации и как она потом изменяется.
Во время угрожающих популяциям изменений среды клеточная концентрация может быть критической. Для зашиты от токсического действия факторов среды бактерии имеют индуцибельные или какие-либо другие, пока неизвестные системы. Эффективность зашиты зависит от численности микроорганизмов, осуществляющих детоксикацию в результате совместной деятельности. Защиту против медленно проникающих токсичных веществ способен обеспечивать сам по себе быстрый рост клеток. Все вышеперечисленные взаимоотношения можно проиллюстрировать на примере взаимодействия рифам- пина с клетками Е.
сой ~361 В достаточной концентрации клетки способны инактивировать рифампин в определенных дозах; после их обработки антибиотиком в постепенно нарастающих концентрациях культуры становятся толерантными к повышенным дозам препарата. Независимо от этого быстро растущие бактерии более устойчивы к антибиотику, чем медленно растущие. Возможно, это объясняется тем, что препарат не успевает эффективно проникать в быстро растущие клетки. Например, если антибиотик добавляется в относительно высокой концентрации, а затем разводится до низкой, то происходит подавление роста в условиях, при которых обычно низкие концентрации не оказывают ингибирующего действия.
После того как в результате кратковременной обработки культуры высокими дозами антибиотика рост замедляется, ингибирование остается постоянным, поскольку препарат успевает проникать в клетку и в этих условиях процесс ингнбирования вызывается и низкими дозами антибиотика. Мицелиальнып тип роста Изучать рост микроорганизмов, имеющих мицелий, сложнее, чем рост более «удобных» микроорганизмов, клетки которых бинарно делятся и затем немедленно расходятся. Проблемы и методы изучения роста колоний 447 »1АСТЬ П РОСТ уже обсуждались Кэлэмом [12] и Кохом [33], поэтому мы рассмотрим их здесь очень кратко. Фильтровать и взвешивать высушенный или влажный мицелий удобнее, нежели мелкие немицелиальные клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
