Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 90
Текст из файла (страница 90)
При оптимальном разведении облегчается перемешивание. 3. 0,1 мл разведенной культуры наносят на поверхность агара в чашке Петри. Для этого 2 — 3 капли капают на поверхность, а оставшуюся в пипетке жидкость выдувают (в автоматической пипетке нажимают поршень до упора).
Это делают быстро, поскольку клетки имеют тенденцию немедленно прикрепляться к твердому субстрату. 4. Шпатели (рис. 11.1) стерилизуют погружением в спирт, удаляют избыток последнего и обжигают в пламени горелки. Шпатель можно изготовить из большой скрепки для бумаг (Ыап! беш. Иез!1!пй). Скрепку изгибают, как показано на рисунке, надевают на ее конец специальную тефлоновую трубку (№ 16, Ята!1 Раг(з, 1пс., М!аш(, г1а.) и слегка нагревают на огне, чтобы трубка плотно охватила проволоку. Часть скрепки, используемую в качестве ручки, можно изогнуть наиболее удобным образом.
По сравнению с толстыми стеклянными палочками такой шпатель обладает низкой теплоемкостью, быстро остывает и значительно более инертен по отношению к бактериальным клеткам. Подобный шпа. 11 ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА тель можно так же быстро изготовить из пастеровской пипетки. 5. Культуру равномерно распределяют по агару в чашке, стараясь покрыть всю его поверхность вплоть до периферии.
Равномерный посев требует определенного опыта. После инкубации проверяют распределение колоний на всех чашках, чтобы убедиться в равномерности посева. Лучшими для оценки равномерности посева являются чашки с наибольшим числом выросших колоний, хотя подсчет колоний в этом случае затруднителен. Если количество колоний, выросших вокруг наносимых на агар капель суспензин, выше, чем на остальной поверхности, то технику распределения следует улучшить.
Капли влаги на крышках чашек Петри удаляют интенсивным встряхиванием крышек. Чашки с разлитым в ннх агаром следует подсушивать до тех пор, пока капля жидкости (0,1 мл), наносимая пипеткой, не поглотнтся агаром в течение 15 — 20 с. 6. Перевернутые чашки инкубируют прн постоянной температуре в хорошо термостатируемой комнате или камере (разд. 6.3). Лучше использовать закрытые контейнеры, однако нх не следует перегружать чашками.
Если тем не менее без этого не обойтнсь, увеличивают время для выравнивания температуры чашек и камеры, что особенно важно при работе с температурочувствительными мутантами. Инкубация в закрытых контейнерах позволяет также избежать токсического воздействия вредных газов, которые могут присутствовать в атмосфере термостатируемых помещений общего назначения (например, паров уксусной кислоты, используемой для обесцвечивання гелей). Непрозрачные контейнеры защищают светочувствительные компоненты сред и красители от инактивацнн светом. Наконец, в контейнерах среда в чашках не высыхает, н поэтому такие чашки пригодны для наблюдения за медленно развивающимися или поздно появляющимися колониями.
Еще одной проблемой является поддержание необходимой концентрации СОМ поскольку в СОз могут нуждаться даже организмы, выделяемые обычно в отсутствие высоких концентраций этого газа. Эта зависимость особенно наглядно выявляется в случае нанесения на агар отдельных редких клеток из разбавленных суспензий и при иикубацин в обыч- ЧАСТЬ 1!. РОСТ ной лабораторной атмосфере.
Хотя этн проблемы возникают далеко не всегда, о них надо помнить. 7. Наблюдение за чашками начинают до того, как колонии разовьются в полной мере. Часто вырастает слишком много колоний. Тогда прибегают к дополнительным разведениям и посевам либо к подсчетам (с помощью лупы) мелких недоразвившихся колоний, опасность слияния которых меньше, нежели в случае крупных развитых колоний.
8. Подсчет колоний следует вести при хорошем освещении, однако соответствующее оборудование далеко не всегда придается к обычным счетчикам колоний. Иногда увеличительные линзы укрепляют в оправе очков или используют лампы с линзами. Счет ведут либо «вручную», отмечая чернилами колонии на дне чашки Петри„ либо с помощью электронного счетчика или телевизионного сканирующего устройства. Отдельные колонии на поверхности агара можно отмечать прикосновением к ним специального красящего карандаша. Далеко не все виды таких карандашей способны окрашивать колонии на агаре, Лучше всего использовать окрашивающие карандаши фирмы ЕЬегйагд ГаЬег Монро!, причем одни красители (например, ггепсЬ Огееп № 898) окрашивают колонии лучше, чем другие. Для дифференциального подсчета можно использовать несколько красителей. Некоторые исследователи предпочитают считать единичные колонии в уме, а десятки откладынают на клавишном счетчике.
Прн работе с электронными сканирущими счетчиками особое внимание уделяют тому, чтобы избежать ошибок, источником которых могут служить частички грязи или не видимые невооруженным глазом дефекты в стеклянных нли пластмассовых чашках. Для повышения контрастности колоний и уменьшения числа ложнопозитивных случаев в агар вводят красители. 11.2.2. Посев в многослойный агар 1. Готовят чашки Петри с первым слоем агаризованной среды (1,51)Ь агара, толщина слоя около 0,4 см).
Как первую, так и последующие среды наливают в чашки, установленные на строго горизонтальной поверхности (с помощью уровня). И. ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА Заполняют небольшие (13Х100 мм) пробирки 2,5— 3 мл 0,7Р7 -ного расплавленного агара. Удобно иметь приготовленные заранее бутыли с агаровой средой, содержащей основные компоненты. Агар в бутылях расплавляют (это можно сделать в микроволновой печи при наличии определенного навыка, следя за тем, чтобы агар бурно не вскипал) и добавляют к нему необходимые питательные компоненты, красители и ингибиторы. Аликвоты готовой горячей среды переносят пипеткой в предварительно прогретые до 45'С серологические пробирки (13;к,100 мм).
Работа с горячей средой снижает вероятность заражения посторонними бактериями. При 45'С агар остается жидким в течение нескольких часов. При 50'С это время еще больше, однако при этой температуре гибнут многие бактерии. 2. Пробы с культурой разводят, как описано выше (разд. 11.2.1). 3. Переносят чашки Петри в комнату с температурой 25 — 30'С.
4. Делают отметку на наружной стороне серологической пробирки и наносят на внутреннюю поверхность пипеткой О,1 мл разведенной пробы. 5. Расплавленный агар немедленно выливают из пробирки в чашку Петри таким образом, чтобы, вытекая, он смыл приставшие к стеклу клетки на месте внесения пробы. Это позволяет не только перенести все клетки в чашку, но и равномерно перемешать их с агаризованной средой; кроме того, при этом уменьшается адсорбция клеток на стекле.
6. Чашку наклоняют н покачивают, чтобы расплавленный агар, содержащий клетки, равномерно покрыл всю поверхность первого слоя. 7. Чашку помещают на установленный по уровню столик н дают агару застыть. 8. Эту процедуру проводят н с другими чашками, необходимыми в опыте. 9. Добавляют пипеткой нли выливают из пробирки 2,5 — 3 мл 0,7 )е-ного расплавленного агара на застывшую поверхность и покачиванием равномерно распределяют его.
Чашки помещают на установленный по уровню столик и да1от застыть третьему слою агара. 10. Чашки можно инкубнровать в любом положении, ЧАСТЬ 11. РОСТ поскольку при яспользовании этого метода возможность заражения н высыхания значительно ниже, чем при методе посева в чашках на поверхность агара. 11. Следят за ростом колоний н просчитывают их. Колонии, растущие под поверхностью, более компактны, имеют четко очерченные края н меньший размер по сравнению с обычными поверхностными колониями. Их труднее считать, однако увеличительные стекла или специальные насадки на очки помогают снизить напряжение глаз в процессе счета.
Дополнительные затраты труда, необходимые при посеве в многослойный агар, оправдываются, когда вырастает очень много колоний. Равномерность распределения колоний по чашке определяют визуально. Если распределение действительно равномерно, просчитывают колонии в какой-либо части чашки и затем получают общее их число на чашках перемножением. Использование бинокулярной лупы позволяет избежать трудностей, связанных с подсчетом мелких и близко расположенных колоний, и в ряде случаев «спастн» эксперимент, узким местом которого оказался именно этап подсчета колоний. 11.3.
НАИбОЛЕЕ ВЕРОЯТНЫЕ ЧИСЛА Концентрация живых клеток может быть определена методом наиболее вероятных чисел (НВЧ), заключающимся в математической оценке вероятности присутствия жизнеспособных клеток в серийных разведениях, в которых рост уже не регистрируется. Готовят несколько параллельных разведений клеток в ростовой среде и после ннкубацни учитывают пробирки с выраженным бактернальным ростом. Полагают, что в пробирки, в которых отсутствует рост, нс было внесено даже одной клетки, способной расти.
Поскольку распределение частиц должно подчиняться формуле Пуассона (см. ниже), среднее число клеток в таком разведении можно вычислить по формуле Р,=е-, где т — среднее, а Р,— отношение количества пробирок, где отсутствует рост, к общему числу пробирок. Затем среднее умножают на фактор разбавления и на объем инокулята, который дает заметный рост исходной культуры. Метод НВЧ статистически весьма неэффективен, поскольку каждая !!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
