Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 94
Текст из файла (страница 94)
Наиболее подходящую аппрокснмированную кривую можно затем рассчитать с помощью простых программ на любом компьютере, в том числе микрокалькуляторе. В нашей лаборатории для таких работ используются спектрофотометры типа Сагу или Уе!зз с узким пучком света. Проверка ряда других спектрофотометров с суспензиями, содержащими бактерии различных размеров (30), показала, что при величинах клеток в интервале 0,4 — 2 мкмз результаты в пересчете на сухой вес практически одинаковы.
Поскольку для всех бактерий можно использовать одну и ту же кривую, ясно, что формулы пересчета приложимы ко всем неокрашенным прокариотам тех же размеров. Если измеряемое поглощение ниже значения 1,1, квадратичная кривая, проходящая через начало координат, адекватно удовлетворяет экспериментальным данным: Ах =ахи' — ЬА)Р', где )Р' — сухой вес бактерий, а ах и ЬА — константы, используемые при данной длине волны Х. Эмпирические формулы для двух длин волн выглядят следующим образом А4го=7~114 10 айУ вЂ” 7 702 10 %з, Амо=2 742'10 % 0 138,10-в)Рз С увеличением длины волны коэффициент первого порядка )г'(ах ) снижается. Этот коэффициент можно вычислить и при других длинах волн, поскольку он обратно пропорционален длине волны во второй степени (точнее, в степени 2,!!). Соответственно при других проме- 484 !! ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА жуточных длинах волн ах можно вычислить из уравнения ах= 2,439/йв ".
При других длинах волн нет правила для определения ЬА, но Кэйвенагу 1261 удалось измерить эту величину при некоторых длинах волн. Эта константа зависит от формы клеток, внутренней гетерогенности суспензии, типа фотометра и т. д. в большей степени, чем ах . Фактически при высоких мутностях суспензия квадратичная аппроксимация удовлетворительна лишь частично. Именно поэтому, а также из-за осложнений при фотометрни предпочтительнее работать при значениях поглощения ниже 1.
С увеличением длины волны снижается величина РА, многократно снижается рассеяние света на детекторе и улучшается линейность. Для обычных подсчетов величины Ф' можно использовать приведенные выше уравнения, выразив выход в микрограммах сухого веса на миллилитр: Ф'= 461,81 (1 — 1 1 — 0,60881А,А,), йУ= 9929 (1 — Р 1 — 0 07347 4ввв). Последнее уравнение с той же точностью можно выразить иначе: Ю = 364 74Аввв+6 7Авввв.
Все три выражения применимы для значения поглощения меньше 1. Если бактерии не окрашены, длину волны выбирают на основании следующих соображений. Чем меньше длина волны, тем меньшую мутность способен регистрировать прибор, т. е. при этом он обладает повышенной чувствительностью; следовательно, при малых длинах волн могут измеряться низкие концентрации клеток.
И наоборот, для некоторых целей желательна пониженная чувствительность, поскольку иногда представляют интерес плотные суспензии и желательно избегать дополнительного разведения. Более длинные волны предпочитают также использовать в связи с тем, что многие ростовые среды содержат вещества, поглощающие в голубой части видимого спектра, и поэтому кажутся жел- ЧАСТЬ !П РОСТ тыми или коричневыми. В связи с этим лучше проводить измерения при 660 нм, поскольку при этой длине волны контрольные пробы со средой почти не отличаются по поглощению от проб с водой. Использование более длинных волн нежелательно, так как для многих фотометров могут понадобиться дополнительные фотоумножители. При более коротких длинах волн химические изменения, вызываемые бактериями, окисление воздухом или различные режимы автоклавирования могут влиять на интенсивность светопропускания в сложных средах.
В любом случае при работе с новой средой необходимо сравнить надосадочную жидкость, полученную после осаждения выросшей культуры, с исходной средой роста и определить, образуются или исчезают в процессе роста бактерий пигменты. Фотометрию с окрашенными микроорганизмами проводят при определенной длине волны, которую выбирают таким образом, чтобы избежать поглощения в области спектра, соответствующей цвету клеток. Можно также выбрать такую длину волны, при которой поглощение света клеточными пигментами максимально, и затем определить количество биомассы, используя пигмент в качестве индикатора.
Сложность в этом случае заключается в том, что содержание пигмента зависит от условий культивирования. При отсутствии узколучевого спектрофотометра для постоянных каждодневных исследований можно пользоваться вышеприведенной формулой для сухого веса, снимая показания на приборе лишь периодически. Для этого сначала строят калибровочную кривую, измеряя мутность известной суспензии на спектрофотометре, и затем используют приведенные выше формулы. С одинаковыми по форме и размерам кюветами мутность, измеренная в широколучевом спектрофотометре, меньше, чем измеренная в узколучевом (т.
е. широколучевой спектрофотометр характеризуется меньшей чувствительностью). Это осложняет работу, поскольку каждый раз при замене фотоумножителя или источника света возникает необходимость в новой калибровке. В некоторых приборах заметное изменение поглощения происходит даже при замене или удалении держателя для кювет.
Поэтому рекомендуется частая настройка таких 486 и. измвеение Роста приборов по узколучевому спектрофотометру. Например, чувствительность спектрофотометра типа Вескшап-РБ резко изменяется после помещения в кюветное пространство термостатирующего устройства [30]. Это неудивительно, поскольку за счет такого устройства удлиняется рабочее расстояние, и тем самым этот спектрофотометр по своим параметрам (в том числе чувствительности) становится похож на аналогичный узколучевой прибор. При работе со спектрофотометрами, в которых используются дифракционные решетки, необходим специальный контроль. Это связано с тем, что по мере старения реплик решетки спектр искажается, в результате чего на фотоумножитель попадает больше рассеянного света.
Колориметр типа К!е11-Бштипегзоп Это, пожалуй, один из лучших колориметров, отличающийся невысокой стоимостью, надежностью и стабильностью. Он используется многими исследователями вот уже более 40 лет. Стабильность прибора объясняется тем, что все колебания интенсивности его источника света компенсируются двухлучевой системой. Он имеет простой и не очень чувствительный детектор на СдЯ, который обеспечивает сигнал, достаточный для регистрации гальванометром. Детектор в этом колориметре отнесен далеко от кювет и поэтому улавливает меньше рассеянного света, чем в других аналогичных приборах.
Калибровка этого прибора отличается от калибровки современных приборов: поглощение в 1 ед. на других приборах соответствует поглощению в 500 ед. на шкале колорнметра К!е11-Яппппегзоп. Показания снимаются настолько медленно, что мутность суспензии палочковидных бактерий становится стабильной ко времени, когда заканчивают подводку шкалы. К этому времени клетки приобретают случайную ориентацию. Следует быть особенно внимательными при снятии показаний со шкалы прибора н подведении шкалы гальванометра к нулю.
Чтобы избежать ошибки, связанной с параллаксом, необходимо найти постоянное положение. Основным недостатком этого прибора является отсутствие устрой- ЧЛСТЪ П РОСТ ства для настройки темиового тока. При рассеянии иа внутренних поверхностях прибора, при отражении от стеклянных стенок кюветы и т. п. свет может попасть на детектор, минуя содержимое кюветы. Чтобы учесть этот эффект, свойственный другим приборам без настройки темпового тока, кювету заполняют раствором с очень высоким поглощением (07а пропускания) .
Для колориметра типа К!е11-Яппппегзоп должно иметь место зашкаливание прибора, т. е. стрелка должна находиться на уровне вертикальной линии, которая образует левую сторону буквы К в слове СОР!'К16НТ. Частые нарушения калибровки могут приводить к постоянной ошибке, вызывающей дополнительные отклонения от закона Ламберта — Бара. В этом случае необходимы специальная настройка прибора, ремонт или замена источника света.
Частично эту проблему можно разрешить путем повторного нанесения черной краски на внутренние поверхности прибора. 11.4.2. Нефелометрия Хотя основная часть света рассеивается практически в прямом направлении, для измерения концентрации бактерий используются приборы, в которых светорассеяние измеряется под углом 90ч к падающему пучку света. Такие приборы называют нефелометрами. По этому же принципу концентрацию бактерий можно измерить в спектрофлуориметре, установив монохроматоры возбуждения и эмиссии на одну длину волны. Очень высокая чувствительность нефелометров позволяет измерить крайне низкую концентрацию бактериальных суспензий. На практике основная трудность заключается в возникновении ложных сигналов за счет присутствия в среде примесей; ее можно частично преодолеть предварительной ультрафильтрацией среды.
Вторая трудность заключается в необходимости постоянной калибровки прибора при серийных измерениях. В отличие от спектрофотометра для нефелометра или спектрофлуориметра калибровка заключается в установке темпового тока таким образом, чтобы контрольная проба, содержащая только компоненты среды, давала на шкале нуль. Затем шкалу устанавливают на фиксированный и изменения гостл ответ, вызываемый стандартным рассеивающим раствором, т. е. строят стандартную кривую. Поскольку бактериальная суспензия нестабильна, она не подходит в качестве стандарта; эту роль может играть пластинка опалового стекла или суспензия стеклянных бус, используемых для разрушения какого-либо биологического материала. Обычно при калибровке прибора используют запаянную пробирку, содержащую стандарт мутности.
Затем строят стандартную кривую, отражающую зависимость между показаниями прибора и концентрацией бактерий в серии разведений. При высоких концентрациях бактерий такая кривая нелинейна. Хотя существует очень много приборов для измерения рассеянного света и ими широко пользуются уже довольно давно, всем им присущ недостаток, который заключается в том, что от частиц, сравнимых по размерам с бактериями, значительная часть света рассеивается почти в прямом направлении (рис. 11.3).
Чтобы зарегистрировать такой рассеянный свет, необходимо иметь возможность ориентировать детектор прибора таким образом, чтобы он улавливал световые пучки, отличающиеся по направлению от пучка падающего света лишь на несколько градусов. Важно также, чтобы детектор не испытывал помех со стороны неотклоняющегося света падающего пучка. Иными словами, необходим очень хорошо коллимированный пучок света.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
