Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 96
Текст из файла (страница 96)
Статистические тесты Большая часть статистики, изучаемая в элементарных курсах, связана с определением соответствия имеющихся данных гипотезе. Обычно вычисляют вероятность (Р) того, что наблюдаемые отклонения от гипотезы случайны. Если величина Р мала, то гипотеза может быть еще верна, хотя и маловероятна. Статистические тесты обычно проводятся в предположении, что данные подчиняются гауссову распределению. В бактериологии во многих случаях это предположение следует подвергать сомнению, однако в общем статистические методы, если они применимы, могут быть очень полезны. Среднеквадратичное отклонение, определенное выше, часто путают со среднеквадратичной ошибкой, называемой также среднеквадратичным отклонением среднего, Среднеквадратичное отклонение характеризует отклонение индивидуального измерения от среднего многих измерений.
Среднеквадратичная ошибка характеризует насколько близко наблюдаемое среднее к истинному значению среднего, которое определяется в предположении бесконечного числа наблюдений. Единственный тест, упоминаемый ниже, — это Ртест Стьюдента. Он применяется к разности средних двух групп.
Разность делят на среднеквадратичную ошибку для объединенных данных и вычисленное значение сравнивают со значениями в таблицах, получая таким образом величину Р. Для пользования таблицами необходимо знать количество измерений, а также возможность отклонения от среднего в обе стороны или только в одну. Если величина Р очень мала, то гипотезу об идентичности двух популяций можно отвергнуть.
В последние годы был разработан дисперсиоиный анализ, являющийся ветвью статистики. В настоящее время его можно применять для решения многих проблем; во многих областях он заменяет использовавшиеся ранее более специализированные методы. Сейчас овладе- ЧАСТЬ 11. РОСТ нис статистическими методами (там, где они примени. мы) в бактериологии требует значительно меньших затрат труда, чем раньше. 11.5.3. Распространение ошибок Точность обшей оценки зависит от точности измерений ее составляющих. Так, ошибка по Пуассону при подсчете колоний и ошибка при разведении вносят свой вклад в ошибку при определении концентрации бактерий в исходной неразбавленной суспензии. Как правило, дополнительные ошибки только снижают точность измерений. Даже если ошибки на различных этапах компенсируют друг друга, в среднем они увеличивают общую ошибку. Когда ошибки одного измерения не зависят от ошибок другого, общую ошибку можно вычислить с помощью двух правил для «распространения ошибок».
1. Если две величины (х и у) складываются или вычитаются, то среднеквадратичное отклонение (з) составной величины равно 2. Если две величины умножаются или делятся, то коэффициент вариации (к.в,) составной величины равен к.в.„,„=к.в.,1„=)/к.в. э+к.в.„', В качестве иллюстрации используем второе правило для оценки общей ошибки счета колоний в чашках, засеянных пробами из пяти последовательных 10-кратных разведений.
Если разведения проводили в 5 этапов и прн одном 10-кратном разведении ошибка, обусловленная использованием пипетки, характеризуется к.в.=0,02, то общая ошибка для всех 5 этапов разведения будет равна )15.0,02. Этот результат получен повторным использованием второго правила. Его следует объединить с ошибкой по Пуассону. Поскольку наилучшая оценка к.в. для ошибки по Пуассону равна 17)1585,5, общий к.в, определяют следующим образом: кв. = )71/585+ 5 (002)'= УО 001709+О 00200= 5 1Р7а. 496 и, измеРение Ростл Эта ошибка в 6,1% состоит из ошибок, накапливающихся при использовании пипеток !У5 2% =4,47%), и ошибки по Пуассону, равной 4,1% =100/)~585,5. Объединение их по указанному правилу дает меньшую величину, чем их сумма (4,!+4,47=8,57%), но большую, чем наибольшая ошибка из составляющих.
Из рассмотренного примера следуют два важных экспериментальных вывода. Во-первых, нет необходимости увеличивать точность одного этапа эксперимента, пока существуют источники других сравнимых по величине ошибок. Во-вторых, если операцию необходимо провести много раз, следует подумать о том, как провести ее как можно более точно, и затем не прибегать к статистическим расчетам. В предыдущем разделе, например, мы пренебрегли ошибкой, обусловленной использованием пипетки, потому что предполагалось, что отбор проб пипеткой был выполнен очень точно. Это имеет смысл делать в том случае, если к.в.
данной ошибки меньше половины ошибки по Пуассону. Предположим, что точность каждого отбора пробы пипеткой равна 1% вместо 2% . Тогда общая ошибка, обусловленная использованием пипетки, составляет УГ1% =2,23%, а общий к,в. соответственно равен )~4,1~7ь'+2,23%э=4,7%, т. е. лишь немного больше, чем сама ошибка по Пуассону при подсчете. Подобные рассуждения используют в тех случаях, когда производят вычитание фоновых величин и величин, характеризующих контрольные пробы, где применимо первое правило распространения ошибок, или после стандартизации прибора н метода, где применимо второе правило. При использовании контрольных измерений ошибки должны быть снижены благодаря многократным измерениям или благодаря более точному измерению по сравнению с опытными данными, так что они не вносят существенного вклада в общую ошибку.
1!.5.4. Коэффициент точности Существует очень мощный общий метод, пригодный для различных экспериментальных условий в диапазоне от крупных природных экосистем и до капли культуры 497 члсть и. Рост на сетке, предназначенной для электронной микроскопии. Метод применим к различным эталонным частицам — бактериям, частичкам ферритина, полистироловым шарикам, абортиьно трансдуцированным бактериям, плазмидам, вирусам и т. д. После перемешивания суспензии отбирают пробы и с помощью соответствующего метода определяют отношение числа изучаемых бактерий к числу эталонных частиц. Метод можно проиллюстрировать для случая микроскопических мазков, содержащих эталон (полистироловые бусы) и неизвестное количество клеток изучаемых микроорганизмов. Мазок готовят из известных объемов клеточной суспензии и взвеси бус известной концентрации.
Из произведения концентрации бус на отношение количества клеток к количеству эталонных бус определяют концентрацию клеток. В этом случае применимо второе правило распространения ошибок. Если концентрация эталонных частиц в исходном основном растворе заведомо определена без ошибок, то к.в. неизвестных частиц можно определить по формуле к.в. = ~1РЧ„+ 1/У„ где И~ и У, — количество неизвестных и эталонных час. тиц соответственно.
Для минимизации общего числа подсчетов Л/„в этой формуле должно быть примерно равно Ж,. Тогда к.в, будет примерно в 12=1,4 раза выше, чем в случае, когда подсчитывалось бы бесконечное число эталонных частиц (или неизвестных частиц). 11.5.5.
Коррекция на совпадения Коррекцию на совпадение необходимо проводить в ряде случаев, например при наличии очень большого числа колоний на чашке или клеток в квадрате счетной камеры, а также при высокой радиоактивности, регистрируемой счетчиком. Предположим, что при подсчете числа колоний две клетки, находящиеся ближе чем на расстоянии г, учитываются как одна.
Пусть У~ — истинное количество колоний, У, — результаты счета, а Я— Н,НЗМЕРЕННЕ РОСТА радиус чашки Петри. Рассмотрим единственную клетку. Вероятность того, что другая клетка находится от нее на расстоянии не более г, равна Мспг'/пц', или й/кз/Ю Если зарегистрировано Ж, колоний, то потеря в счете составит /у,Фпая'. Отсюда /Р, =/У.+й/.й/ г'/Р'= й/.
(1+ ей/~) где с=гз/Яз. При незначительной коррекции обычно удобно заменять в правой части формулы Л/~ на й/,. Из этой формулы видно, почему 4-кратное снижение размеров колонии в 16 раз снижает коррекцию несовпадения при таком подсчете. Это является основой описанного выше метода посева в многослойный агар. 11.5.6.
Расчеты экспоненциального роста При постоянных условиях, когда межклеточное взаимодействие мало в течение достаточно длительного времени, ожидается, что рост, измеряемый любым методом, происходит в соответствии с формулой Х=Х,еь'. Ее можно переписать в любой из нижеследующих эквивалентных форм: 1пХ=1пХ,+Л/, 1ЕХ=1ЕХ0+Л//2 303 или Х= Х,2цг, В последней формуле Т, — время удвоения, которое можно рассчитать по формуле Т=(!п 2)/Л=0,6931/Л. Кроме Л для обозначения удельной скорости роста (или константы скорости роста) используют многие другие символы, в том числе а, /з и р. Это необходимо знать, поскольку они встречаются в ряде статей без определения.
Наибольшая путаница происходит с символом р, который в литературе используется как для обозначения удельной скорости роста (при проточном культивировании), так н для обозначения числа удвоений культуры в час (в литературе по физиологии клетки). В послед- чАсть и. Рост нем случае в значение 11 входит множитель !п2= 0,6931.
Чтобы избежать путаницы, удельную скорость роста лучше обозначать символом Х, так как его редко применяют для других целей в микробиологии. Для времени могут использоваться любые единицы, но обычно его выражают в часах. Время удвоения (Тз) выражают как в минутах, так и в часах. 11.5.7. Построение и аппроксимация кривой в случае экспоненциального роста Существует несколько альтернативных способов аппроксимации данных в модели экспоненциального роста. Все они одинаково надежны, но отличаются между собой степенью точности и количеством извлекаемой из них информации.
Наиболее простой подход заключается в том, что строят график зависимости натуральных логарифмов концентрации клеток (или сухого веса биомассы, или другого измеряемого в процессе роста параметра бактерий) от времени и определяют наклон получаемой прямой. Если шкала времени выражена в часах, то наклон будет выражаться в час '. Здесь возникают два вопроса.
Насколько прямая линия соответствует имеющимся данным? Отражает ли полученная линия всю совокупность данных? Можно использовать десятичные логарифмы с основанием 10; в этом случае наклон следует умножать на 2,303=1п10. При использовании логарифмов с основанием 2 (таблицы приведены в работе !61) наклон умножают на 0,6931=!п2; последний способ имеет свои преимущества, поскольку величина, обратная наклону, выраженному таким образом, представляет собой время удвоения. Независимо от того, какое используется основание логарифма, на шкалу следует наносить как характеристику, так и мантиссу. Удобно пользоваться бумагой с полулогарифмической шкалой (Кен((е! апд Еззег Со., № 46-4860).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
