Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 91
Текст из файла (страница 91)
ИЗМВРЕНИЕ РОСТА пробирка соответствует только небольшой части поверхности чашки Петри. В связи с этим приходится либо использовать много пробирок, либо удовлетвориться весьма приблизительным результатом. Одним из преимуществ метода НВЧ является возможность его использования в отсутствие способа культивирования бактерий на твердой среде. Второе преимущество заключается в том, что он удобен в случае высокой вариабельности кинетики роста. Предположим, что некоторые клетки нз смешанной культуры растут быстро, образуя на агаре крупные колонии, которые, распространяясь по поверхности, маскируют появляющиеся позже мелкие колонии интересующего нас микроорганизма. Хотя количество таких мелких колоний может быть больше, их невозможно учесть на чашках из-за присутствия колоний более подвижных или быстрее растущих бактерий.
Третье преимущество метода НВЧ состоит в том, что в присутствии не представляющих интереса организмов и в отсутствие подходящего метода селекции его можно использовать для выявления легко обнаруживаемых продуктов (например, пигментов или антибиотиков), продуцируемых изучаемыми микроорганизмами. В этом случае, несмотря на более выраженный рост контаминирующих микроорганизмов, количество исследуемых батерий определяют по числу пробирок, где образование характерных продуктов отсутствует. И наконец, метод НВЧ используют в случае, если агар или другие отверднтели содержат некоторые факторы (например, тяжелые металлы), которые изменяют достоверность подсчета илн взаимодействуют с изучаемыми бактериями. Подсчет по методу НВЧ помогает ускорить современная лабораторная техника.
Существуют, например, специальные устройства для заполнения лунок в пластмассовых пластинах, имеющих до 144 лунок. Для подсчета лунок, в которых рост отсутствует, используют сканирующие устройства, а для заполнения небольших пробирок широко применяются автоматические и полуавтоматические пипетки. Благодаря этому появляется возможность проверять значительно больше культур, чем с помощью классических методов, в которых используют фиксированное число разведений и фиксированное число 467 чАсть и.
Рост бО бО КоО н й УО 6. а. Я 20 О ГО 20 ЮО ОО Лроионм гаорыпьных пробырок пробирок. Все зто заставляет отказаться от старых таблиц и приемов вычислений и искать новые подходы к проблеме и новые методы расчета. Несмотря на статистическую незффективность, при работе с одним разведением метод НВЧ наиболее точен в том случае, когда среднее число способных неопределенно долго расти бактериальных клеток составляет 1,59 на пробирку 118]. Это соответствует положению, когда 20,8о)о пробирок остаются стерильными (рис. 11.2).
Если предполагаемое число клеток в исходной суспензии известно довольно точно, то все имеющиеся пробирки следует засеять нз разведения культуры, соответствующего величине 1,59. Точность быстро падает при отклонении от оптимальной величины, особенно при выходе за пределы интервала 1 — 2,5 клетки на пробирку. Так, Среднее чыспо кпоюок й пробырко 70 б гб (ОЗ 10 О)д Рис. 11.2. Ошибки (коэффициент вариаций), воз. иикающие при использовании метода наиболее вероятных чисел (НВЧ), как функции относительного числа сохранивших стерильность пробирок (нижняя абсцисса) и среднего числа клеток иа одну пробирну (верхняя абсцисса), Соответствующие оптимумы имеют место при числе стерильных пробирок 20,8 и среднем числе клеток 1,89. Пробирки (л) готовят при одном разведении.
11. ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА работа с 10-кратным (по сравнению с оптимальным) разведением не дает никакой информации о среднем числе клеток. Соответственно если предполагаемое число жизнеспособных клеток находится в пределах 5-кратного разведения, то целесообразно использовать все пробирки для получения разведения, предположительно соответствующего 1,59 клетки на пробирку, и исходить при этом из предположения, что истинное число жизнеспособных клеток находится в середине возможного интервала. Обычно, однако, ориентировочная информация отсутствует, и необходимо готовить ряд разведений, например в 10-кратном нли каком-либо ином интервале. В этом случае можно отбросить данные по разведениям, где процент сохранившихся стерильными пробирок лежит вне интервала 8 — 36 или (если допустим более широкий интервал ошибок) вне интервала 5 — 50.
Ошибку для разведений в пределах интервала можно найти или интерполировать по данным рис. 11.2. Этот метод прост, но требует много времени. Поэтому были предложены статистические приемы, позволяющие объединять данные, полученные с использованием различных разведений и определенным числом пробирок для каждого разведения. В табл. 11.1 приведены результаты расчетов для определения НВЧ. Они применимы при интерпретации данных, полученных при учете посевов в 10 параллельных пробирок из трех последовательных 10-кратных разведений. Рассмотрев 1000 возможных результатов таких тестов, Халворсон н Зиглер 1211 отмечают 210 случаев, когда величины Р превышают 0,01% (объяснения и определения терминов см.
в сносках к табл. 11.1). Финни 1181 подробно рассмотрел статистические аспекты и подходы к определению НВЧ для параллелей в каждом разведении. Он указывает, что в вычислении, связанном с подсчетом ошибок, существуют определенные преимущества, если серия разведений составляет такой интервал, что по крайней мере в одном разведении в каждой пробирке обнаруживается рост, а в следующем разведении в каждой пробирке роста нет. Но даже и в таком случае точные статистические расчеты весьма громоздки. ЧАСТЬ 1!. РОСТ Таблица 11 1.
Вероятности для метода наиболее вероятных чисел !2Ц' Вероятноеть Вероятнаать код Код 93 10 470 1О 10 1О 10 10 10 10 !О 1О !О !О 1О 10 10 10 1О !О 10 10 10 1О 1О 10 1О 1О !О 1О 10 10 10 !О 10 10 !О 1О !О 1О !О 10 100,0 23,0 16,2 12,0 9,!8 7,02 5,42 4,28 3,49 2,75 1,95 1,74 1,53 1,33 1,16 1,01 1,75 1,57 1,41 1,25 0,399 0,631 0,534 0,456 0,388 0,329 0,442 0,376 0,317 0,275 0,316 0,284 0,253 0,223 0,249 0,221 О, 193 0,217 0,19! 0,164 100,0 38,7 30,2 26,2 25,0 24,2 23,4 21,7 17,3 10,2 0,20 0,80 2,57 6,!7 10,01 9,33 0,01 0,08 0,1! 0,59 17,67 О,О! 0,12 0,99 5,30 18,14 0,04 0,60 3,71 15,14 0,03 0,26 2,!9 9,53 О,!9 1,84 9,03 0,07 0,79 5,02 10 10 1О 1О !О 10 10 !О 10 !О 10 9 9 9 д 9 9 9 9 9 0,209 0,191 0,208 0,188 0,171 0,188 0,169 0,152 0,167 0,150 0,106 0,092 0,078 0,128 О,!27 0,114 0,1!3 0,100 О,!13 0,099 0,086 0,075 0,064 0,064 0,053 0,064 0,053 0,043 0,052 0,042 2,40 6,07 5,26 4,58 3,98 3,46 2,98 2,63 2,28 1,97 0,08 0,16 0,01 0,12 0,68 0,03 0,35 2,44 0,04 0,78 0,04 0,83 9,77 0,04 0,02 0,14 0,08 0,79 0,01 0,28 О,ОО 0,02 0,23 0,08 1,53 0,01 0,3! 7,00 0,02 0,51 3,4 О,О! 0,04 0,27 0,85 2,25 4,80 8,57 11,77 11,02 ЧАСТЬ Н.
РОСТ Продолжение табл. 1.!1 Вероятность Вероятность Код Код 6 2 1 6 2 0 6 1 2 б 1 1 6 1 0 0,45 4,!2 0,06 0,87 8,73 О,!22 0,107 О,!21 0,106 0,092 6 4 0 6 3 2 б 3 1 б 3 0 6 2 2 О,!39 0,153 0,138 0,123 0,137 0,32 0,01 0,20 1,35 0,03 а В таблице указано количество бактерий в 1 мл, вычисленное на основании учета числа пробирок, а которых обнаружен рост клеток после инокуляцнн соответствующими разведениями.
В 10 пробирок вносят по 10 мл кучьтуры, и другие 1О пробирок — на 1 мл и еще в 10 пробирок ~а 0,1 мл. Кад отражает количество пробирок, в «аторых обнаРужен рост; первая цифра «ада — коли. честно пробмрок с наличием роста после ннокуляции 10 мл культуры, вторая и тРетья цифры — то же после ииокуляцин соответственно 1 мл в 0,1 мл культуры. В колонке Х представлена наиболее вероятное число бактерий в 1 мл ииокулята. В колонке Р приведен процент количества случаев воспроизведения кода прп условии неограннчениага числа определений с су«пензией, содержа.
щей число микроорганизмов, указанное в колонке Х. Лрнмеры. Предположим, чта каждым из серии 10-кратнык разведений нс. следуемой культуры ннакулируют 10 пробирок с бульа~гам. Допустим, чта после инкубацни признапи раста обнаружены в случае девяти пробирок, инокулнраваинмх 10-' мл исходной культуры; трех пробирок, инакулнрованнык 10-' мл; 0 пробирок, инокулировавных 10-1 мл.
Кад будет представлен цифрами 230. Соответствующее ему па таблице число Х составляет Од55 Это означает, что НВЧ в восьмом разведении неладной культуры составляет 0,255 бактерий в 1 мл, а НВЧ бактерий в исходной суспензин составляет соответственно 0,255 10'=25 500 000 бактернй в ! мл Если бы такой эксперимент был повторен неограниченна балыков числа раз с такай же исходной сУспензней, РезУльтат васпРоиззадилса бы з 0,237т слУчаев. 472 9 5 ! 9 5 0 9 4 3 9 4 2 9 4 1 9 4 0 9 3 3 9 3 2 9 3 1 9 3 0 8 2 2 8 2 1 8 2 0 8 ! 2 8 1 1 8 1 0 8 0 2 8 0 ! 8 0 О 7 б 0 0,372 0,334 0,408 0,365 0,324 0,290 0,362 0,324 0,288 0,255 0,210 О,! 88 О,!69 0,187 0,166 О,!47 О,!66 0,146 0,128 0,212 0,86 1,78 0,02 0,22 1,13 3,58 0,04 0,26 1,77 6,23 0,14 1,24 7,!2 0,11 1,45 9,3! 0,06 0,88 6,4! 0,02 4 3 0 4 2 1 4 2 0 4 ! 2 4 1 1 4 ! 0 4 0 2 4 0 ! 4 0 О 3 4 0 ! 2 1 1 2 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 2 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0,080 0,080 0,068 0,080 О,'068 0,056 0,067 0,056 0,045 0,076 0,038 0,029 0,028 0,0!9 0,019 О,!1О 0,018 0,018 0,009 0,009 0,43 0,16 2,16 0,01 0,50 7,21 0,02 0,76 14,62 0,04 0,02 0,53 О,!2 0,34 0,34 0,21 0,04 3,05 0,26 11, ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА Таблица !1.к.
Вычисление НВЧ с помощью микрокалькулятора с введенной программой Общая формула: а!р! Е,, =Науч! 1 — е~!' Значсння в примере Самвел 1О 1,0 0,1 10 10 10 к — НВЧ а! — исследуемый объем 71! -- общее количество опреде- лений !О 18 + ГО 1 + ГО 0,1 !11 8 б 1 Вали р! — число определений, в которых наблюдается рост 80 б 01 а,р! Численные значення подставляют в йгормулу: 80 5 о,! — тех +:х+ а !х Н! ЫЛ Обшнй нсследааанныв объем. а-зе» 1 е-х 1 е-о,!х Программнруемый калькулятор перевалят в режим прнбавлення у 1 — е» С помощью современных калькуляторов, в которые вводятся программы, можно, не прибегая к помощи таблиц, определить НВЧ для любых вариантов наборов параллельных пробирок и разведений (табл, 1!.2).
Этот метод хорош и для стандартных серий разведений, 473 к регистру, где У н Х вЂ” содержимое ячеек рабочей памятн. Программа для калькулятора Нем!еИ.Раскате, модель ЗЗЕ, имеет следую. шнй внд 32, 15-1, 1, 11, 32, 71, 51, !3 — 00. чтобы начать работу, нужно нажать клавишу Н/5 Вмбпать значение» !яаернмер, О,З! Очнстнть регистры. Набрать 80, ввести 3,0, нажать клавишу П/3. Набразь 3, ввести 0,3, нажать клавншу и/5. Набрать 0.1, ввести 0,03, нажать клавншу и/5. Записать результат 10б,87 н ачнстнть регнстры. Выбрагь новую величину», скажем 0.25.
Набрать 80, ввести 2,5, нажать клавншу П/3. Набрать 5, ввестн 0,25, нажать клавишу и/3. Набрать 0,1, ввести 0,025, нажать клавишу К/5. Запасать резулшш 113.81 н сравнить его с первым. Полученные результаты находятся па обе стороны от значения Н1 мл, соответствующего исследуемому объему, поэтому проводят ннтерполяцню нлн находят промежуточную велнчнву, стараясь отмскать такое значенве », которое дает для суммы указанных трех слагаемых значенне 111 мл.
В любом случае получаю »=0,27, что соответствует значению, прнведенному в табл. 11 1 часть и. РОст подобных приведенным в табл. 11.1, когда получают наборы цифр (кодов), не представленных в опубликованных таблицах. В случае инокуляцни 10 пробирок в каждом нз трех последовательных 10-кратных разведений, несмотря на суммарное число пробирок 30, точность расчета ниже, чем в случае использования всех 30 пробирок для учета роста в одном разведении н оценки результатов с помощью кривой и~=30 на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
