Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 93
Текст из файла (страница 93)
1!.б. Поглощение (при 420 нм) как функция концентрации бактериальных клеток. Штриховая линия — теоретическая кривая, Сплошная линия — зксперимеятальная кривая, полученная с пятнадцатью разведениями бактериальной культуры (концентрации клеток измеряли по сухому весу биомассы). Она построена путем аппроксимации квадратичной кривой, проходящей через нулевую точку.
0 20 40 бО 00 ((аьцеяарациа баатаериааьаьщ ааемаа, ем~ил ЧАСТЬ П РОСТ фотометров Хе1зз и Сагу. Другие фотометры можно оценить по чертежам, конструкциям их оптических систем, а также путем прямого сравнения поглощения э них клеточной суспензии с поглощением в спектрофотометрах Ее1зз или Сагу. Если спектрофотометр или размер микроорганизма не удовлетворяет упомянутым критериям, во многих случаях надежные измерения можно проводить с помощью стандартной кривой, построенной на основании абсолютного или относительного поглощения. Сложности возникают только тогда, когда физические или биологи.
ческие условия сравниваемых образцов варьируют, поскольку в этом случае экспериментатор не всегда уверен, можно ли использовать одну и ту же стандартную кривую. Все зто приложимо только к разбавленным суспензиям. При величинах поглощения выше 0,3 и при длине волны 500 нм или меньше следует принимать во внимание отклонения от закона Ламберта — Бэра (см. пример, приведенный на рнс. 11.5). Этот вопрос подробно обсуждается в работе 1261. О таких отклонениях часто забывают, и это очень осложняет анализ микробиологической литературы по турбидиметрии. Одним из способов обойти эту проблему является ограничение плотности культуры или разведение ее до плотности ниже 0,3. Однако фотометрические измерения на этом уровне не точны, а разведение с помощью пипеток может явиться источником дополнительных ошибок.
Для измерения малых поглощений крайне важно, чтобы кюветы были тщательно подобраны, очень хорошо промыты и правильно установлены в спектрофотометре. Предпочтительнее проводить измерения при высоких плотностях культуры и затем корректировать их на отклонение от закона Ламберта — Бара. Методика Парадоксально, но при турбидиметрическом определении мутности не существует строго определенной методики. Некоторым исследователям удается получить надежные результаты с помощью любого доступного прибора. Дорогие спектрофотометры характеризуются и, ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА высокой точностью, стабильностью, точной настройкой длины волны и, что самое важное, широким диапазоном измерений поглощения. Это сказывается при измерении слабых поглощений, поскольку такие приборы обладают хорошей электронной стабильностью и повышенной воспроизводимостью положения кювет; сами кюветы имеют тщательно подобранные размеры, а стенки их строго параллельны.
Измерение плотных суспензий также лучше проводить на высококачественных приборах, посколь. ку рассеянный свет при этом очень незначителен. Кро ме того, у них имеются устройства для настройки темнового тока, что позволяет более точно снимать показания. Какие фотометры предпочтительнее для измерения мутности: однолучевые илн двухлучевые? Проверочный тест заключается в том, что фотоумножитель закрывают шторкой или на пути луча помещают непрозрачный объект, а затем следят за кинетикой уменьшения светопропускания.
В простых дешевых приборах наблюдается очень быстрое падение светопропускания, сменяющееся значительно более медленным, которое может продолжаться очень долго. Соответственно после открывания шторки или удаления непрозрачного объекта в таких приборах пропускание вначале происходит очень быстро, а затем наблюдается медленный подъем светопропускания, которое никогда не достигает стабильной величины.
Этот дрейф связан с тем, что фотоумножитель «помнит» условия предшествующего освещения. Двух- лучевые фотометры с одним умножителем лишены этого недостатка, так как в них один и тот же детектор попеременно измеряет контрольную пробу и опытную. Ошибку при измерениях в однолучевом спектрофотометре можно свести к минимуму, если попеременно освещать контрольные и опытные пробы в течение строго определенного времени. Существует н вторая причина установления строго определенного времени измерения мутности даже при работе с высококачественным фотометром. Это — зависимость колебаний мутности от способности палочковидных бактерий образовывать скопления. Чем длиннее палочки, тем более выраженной будет их агломерация в свежеперемешанных культурах. При работе с микро- 481 ЧАСТЬ 11.
РОСТ организмами типа Е. сой с небольшим отношением длины к диаметру их следует перемешать в кювете, поместить в спектрофотометр, выждать определенное время ~например, 45 с) и затем снять показания. Долго выдерживать кювету не рекомендуется, поскольку она нагревается от источника света с образованием конвекционных потоков, вызывающих частичную вертикальную ориентацию палочковидных бактерий. Можно также проводить измерения мутности суспснзий, содержащих палочковидные бактерии, в условиях небыстрого протока, где они ориентируются вдоль потока жидкости ~221. Возле стенок кюветы такая ориентация более выражена, чем в центре, из-за более значительного перепада скоростей потока у стенок.
Безусловно, этот метод требует калибровки в адекватных условиях с использованием организмов, характеризующихся одинаковыми осевыми отношениями, Калибровка Чтобы иметь возможность сравнивать результаты различных исследователей, необходимо провести калибровку спектрофотометра применительно к данной культуре. По причинам, изложенным ниже, не следует реги стрировать показатели мутности в единицах поглощения при определенной длине волны. Вместе с тем, если проводят измерения клеток размером от 0,4 до 2 мкм' на спектрофотометре с узким пучком и допускается пересчет полученных данных на сухой вес, то необходимо использовать факторы пересчета и учитывать отклонения от закона Ламберта — Бэра [30, 32~.
Для калибровки готовят концентрированную суспензию микроорганизмов, выросших в соответствующих условиях, и делают серию разведений хорошо перемешанной суспензия. Измерения проводят максимально быстро, чтобы не возникало необходимости специально прекращать рост клеток и чтобы последний не мешал измерениям. Можно также охладить суспензию в ледяной бане и затем выполнить разведения и измерения или же предварительно подавить синтез белка, например с помощью хлорамфеникола. Все зто снижает колебания количества биомассы в процессе измерений.
В любом и. измеРение Роста случае по окончании всех необходимых измерений готовят повторную серию последовательных разведений исходной суспензии. Данные первой и последней серий измерений должны совпадать. По мере получения данных их используют для построения рабочего графика, подобного изображенному на рис. 11.5, но в данном случае по оси абсцисс откладывают концентрацию суспензни в пробах (в процентах) относительно концентрации исходной суспензии.
Нанося точки рабочего графика, получают представление о форме кривой. После нанесения каждой экспериментальной точки проверяют график, что помогает выявить ошибку наблюдения. Если подозревают, что имеется ошибка, разведения повторяют. В той части кривой, которая наиболее изогнута, делают дополнительные разведения. Повторные разведения позволяют немедленно обнаружить ошибку, тогда как дополнительные промежуточные разведения помогают лучше выявить кривизну графика. Значительных ошибок, обусловленных использованием пипеток, избегают, если исходную суспензию разводят таким образом, чтобы интервалы последующих разведений не были очень широкими и сравнительно большие объемы переносили в мерные сосуды.
Получаемый рабочий график позволяет точно определять рост культуры, поскольку для расчета удельных скоростей роста и времени удвоения необходимо знать лишь относительное изменение биомассы во времени. Однако для многих других целей необходимо проводить не относительные, а абсолютные измерения. К тому же экспериментальные данные по измерению биомассы в абсолютных единицах могут быть точно воспроизведены в других лабораториях, и в связи с этим лучше проводить калибровку в абсолютных единицах. Для калибровки в абсолютных единицах необходимо точно измерить в исходной суспензии некоторые параметры бактериальной биомассы или числа клеток, например сухой вес (1401; см.
также равд. 25.2.2), содержание нуклеиновых кислот (разд, 17.5), белков (разд. 17.6) или общего азота (разд. 17.6.9). Во всех случаях необходимы параллельные пробы и качественный контроль. Для надежного подсчета жизнеспособных клеток используют много независимых разведений, а для ЧАСТЬ и РОСТ микроскопического подсчета в счетной камере — много независимых заполнений этой камеры. Точность иа этом этапе очень важна, так как она определяет судьбу последующего исследования. С помощью спектрофотометрических данных строят график зависимости величии поглощения от числа клеток или биомассы (как показано на рис. 11.5). При наличии компьютера проводят наилучшую линейную, квадратичную или кубическую аппроксимацию. Имеющиеся в большинстве вычислительных центров программы содержат так называемый Г-тест для выбора типа кривой, которая наилучшим образом соответствовала бы данным.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
