Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 89
Текст из файла (страница 89)
1. Метод посева в агар: пробу вносят пипеткой в пустую стерильную чашку Петри, в которую затем вливают расплавленный, но остуженный до температуры 45'С агар; содержимое осторожно перемешивают и дают агару застыть. 2. Метод посева на поверхность агара: небольшие (0,1 мл) объемы разбавленной культуры вносят пипеткой непосредственно на поверхность затвердевшего агара в чашке Петри и затем клетки распределяют по поверхности с помощью стеклянного или тефлонового шпателя.
3. Метод посева в тонком слое: разбавленную культуру вносят в пробирки с небольшим объемом (2,5— 3,5 мл) расплавленного агара (0,6 — 0,75%), затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшего агара, и дают застыть верхнему слою. 4. Метод посева в многослойный агар напоминает предыдущий. Он отличастся лишь тем, что на верхний слой засеянного застывшего агара наливают или наносят пипеткой дополнительный слой стерильного агара. Поэтому все колонии развиваются под поверхностным слоем агара. 5. Метод мембранных фильтров: разбавленную культуру фильтруют через соответствующий предварительно тщательно промытый мембранный фильтр, который затем переносят на питательный агар в чашке или на фильтровальную бумагу, пропитанную концентрированной питательной средой.
Вариантом метода посева в агар является посев на агар (или в агар) во вращающиеся пробирки и микро- трубки 1441; при этом мелкис колонии можно рассматривать в микроскоп 1451. Имеются и другие варианты перечисленных выше методов. Использование автоматического подсчета колоний создает дополнительные специфические ограничения при работе этими методами, 11. ИЗМНРБННН РОСТА однако оно позволяет быстро и без ошибок, свойственных исследователю, просчитывать колонии в чашках Петри, Ниже описываются два метода.
Один из них — это метод посева в чашки на поверхность агара, при котором все выросшие колонии являются поверхностными. Именно на поверхностных колониях изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. Подповерхностные колонии часто отличаются по цвету от поверхностных, так как они развиваются в других условиях аэрации и, следовательно, характеризуются другой способностью к кнслотообразованию и другим окислительно-восстановительным потенциалом.
Второй метод— посев в многослойный агар — обладает своими преимуществами: поскольку здесь все колонии развиваются под слоем агара, они невелики, компактны и могут интенсивно окрашиваться. В чашке в данном случае может вырастать значительно больше колоний по сравнению с другими методами, причем вероятность их слияния невелика. Можно просчитать несколько тысяч колоний на чашке и получить достоверные результаты. Поскольку прн использовании других методов основная сложность заключается в подсчете нарастающего числа колоний на чашку, совершенно очевидно, что в этом плане данный метод явно следует предпочесть другим.
Существует правило, согласно которому оптимальное для подсчета число колоний на чашку лежит в пределах от 30 до 300. Нижний предел устанавливается из соображений статистической достоверности, а верхний — из-за опасности слияния индивидуальных колоний. Указанный 10-кратный диапазон неудобен для многих экспериментов, поскольку в ряде случаев при разведении трудно заранее определить, будет ли число колоний входить в указанный сравнительно узкий диапазон.
Дополнительные усилия по приготовлению чашек с многослойным агаром окупаются тем, что вырастающие в этом случае колонии можно считать в широком диапазоне (от 30 до 2000). Вторым важным преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом питательной среды. Первым слоем в чашки Петри можно разлить минимальную среду с агаром и в таком виде хранить их неопределенно долго. Может храниться так- 459 ЧАСТЬ 11. РОСТ же подготовленная для посева и разлитая по пробиркам минимальная полужидкая среда с агаром.
В агар, используемый для верхнего слоя, можно добавлять необходимые питательные вещества в 1Π— 50-кратном избытке. При необходимости к полужидкому агару добавляют красители или хромогенные субстраты, облегчающие обнаружение колоний. Попыткам ускорить и автоматизировать измерения роста посвящен ряд статей и книг 12, 23). Однако эта область только начинает развиваться, и мы ее здесь обсуждать не будем. Некоторые микроорганизмы обладают высокой чувствительностью к ряду веществ, присутствующих в агаре.
По этому вопросу опубликовали прекрасный обзор Мейнелл и Мейнелл 151. Если под действием этих веществ микроорганизм повреждается, то не исключено, что он нуждается в специальных питательных добавках. Этой проблеме посвящен 26-й симпозиум Общества общей микробиологии 119). Обычно при проведении эксперимента исследователь должен решать, какие условия культивирования ему использовать — те ли, при которых наблюдается высокое выживание, или те, при которых оно низкое.
Появление генетически дефектных организмов порождает свои проблемы, например проблему способности мутантов с поврежденной системой репарации образовывать колонии, поддающиеся счету 1141. Проблемы подсчета клеток в культурах строгих анаэробов обсуждаются в работах 115, 24, 25]. 11.2.1. Посев в чашки на поверхность агара Подходящую агаровую среду разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см). Из ряда методик заполнения и подсушивания чашек можно рекомендовать следующую, 1.
После автоклавирования и добавления термолабильных субстратов (сахаров, красителей, антибиотиков, хромогенных субстратов) закрытую емкость с расплавленным агаром помещают в лоток с горячей (45 — 50'С) водопроводной водой. Агар быстро и равномерно охлаждается, достигает температурного плато выше точки застывания агара (обычно для 1 л агара достаточно ин- 460 Н. ИЗМВРВНИВ РОСТА кубации в течение 30 мин).
При этом образования геля возле стенок емкости не происходит. Такой достаточно охлажденный агар при разливе дает лишь немного конденсата на внутренней поверхности крышек чашек Петри. 2. Агар в чашки Петри заливают возле зажженной бунзеновской горелки. Если на поверхности агара появляются пузыри, пламя горелки немедленно направляют на эти участки, пока пузыри ие лопаются. Обычно для чашки с диаметром 9 см достаточно 15 — 20 мл агара, что соответствует высоте слоя 0,24 — 0,32 см. Чем толще слой, тем менее контрастно выглядят колонии на агаровом фоне. В тонких слоях агара из-за ограничении некоторых питательных субстратов или локального подсыхания агара могут вырастать мелкие колонии н может уменьшаться их число, особенно в истонченных участках агарового слоя. 3.
В зависимости от влажности чашки подсушивают при комнатной температуре 12 — 24 ч. 4. Чашки хранят при 4'С в закрытых пластмассовых контейнерах неограниченное время. Посев производят следующим образом. 1. На основании имеющейся информации готовят разведения культуры таким образом, чтобы получить после инкубации 100 — 200 колоний на чашку. Для подсчетов, однако, можно использовать и чашки в более широком диапазоне числа колоний (30 — 300).
Если колонии мелкие, удается просчитать до 500 колоний в одной чашке. При работе со стеклянными чашками н пипетками для разведения суспензий бактерий используют растворы, препятствующие адсорбции клеток на стекле, например растворы с высокой ионной силой, с низким рН (4 — 5) или содержащие немного нетоксичного анионного детергента. й)ожно также использовать пластмассовые чашки Петри и пластмассовые наконечники на пипетки. 2.
Разведения проводят несколькими способами. Традиционно к 1 мл пробы добавляли большие (99 мл) объемы соответствующего стерильного раствора; однако с усовершенствованием техники все чаще стали использовать небольшие объемы, экономя реактивы и время, необходимое для перемешивания. Современные полуав- 461 ЧАСТЬ Ц. РОСТ Рнс. 11.1. Шпвтеля Слева: взогнутая скрепка для бумаги, нижняя часть которой помеше. нз в тефлоновую трубку. Спрзвз пзстеровскзя пипетка с оплавленным концом, изогнутая в двух местах.
Ручки обоих устройств нзгнбзют, исходя яз сообрзженнй удобства. Обз шпателя облздзют низкой теплоемкостью; левый шпатель благодаря присутствию тефлоновой трубки сорбнрует меньше бактерий томатические пипетки с пластмассовыми наконечниками позволяют работать с очень малыми объемами, однако такие пипетки трудно стерилизовать. Для многих целей можно использовать 0,1-миллилитровую серологическую пипетку н добавлять 0,1 мл культуры к 0,9 нли 4,9 мл раствора, которым разводят пробы (в пробирках 1ЗХ А!00 мм), или к 9,9 мл этого раствора (в пробирках 16Х150 мм).