Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 100
Текст из файла (страница 100)
После появления достаточно хорошего роста в пробирку в стерильных условиях наливают слой минерального масла высотой нс менее 2 см !косяки агара должны быть покрыты полностью) для защиты от высыхания, а также для уменьшения метаболической активности и замедления роста культур 15, 1Ц. Покрытые маслом культуры хранят в вертикальном положении в холодильнике. Для проверки сохранности культур периодически определяют их жизнеспособность.
Культуру под маслом можно пересевать на свежую среду с помощью инокуляционной иглы, а полученную культуру можно снова покрывать стерильным маслом. При обжиге иглы следует позаботиться о том, чтобы брызги масла не попали на окружающие предметы и персонал. Первичную культуру хранят не менее нескольких недель на тот случай, если субкультура окажется загрязненной или бактерии в ней будут иметь измененные свойства.
Этому методу присущи такие же недостатки, как и обычному субкультивированию 1разд. 12.1.1). Кроме того, следует помнить о возможном загрязнении масла. 12.!.3. Обычное замораживание Хранение бактерий в морозильной камере холодильника или обычном морозильнике при температуре от 0' до — 20'С приводит к различным последствиям в зависимости от вида бактерий. В принципе, такой способ хранения не рекомендуется из-за повреждения клеток в эвтектических смесях концентрированных растворов электролитов !например, в такой смеси 1чаС! имеет эвтектнческую точку — 20'С) 114, 171.
Вместе с тем некоторые бактерии при замораживании можно хранить от 6 мес до 2 лет. ЧАСТЬ П РОСТ 12Л.4. Высушивание Большинство культур гибнет при высыхании в лабораторных условиях. Однако некоторыс культуры, особенно спорообразующих бактерий, можно сохранять годами, если высушивать их в соответствующей среде 13) Почва Спорообразующие бактерии можно успешно хранить годами в стерильной почве, высушенной на воздухе 1101. Почву стерилизуют автоклавированием по нескольку часов в течение двух дней. Инокулят из суспензии спор 1по 1 мл) вносят в пробирки, содержащие стерильную почву, и оставляюг при комнатной температуре до заметного высыхания.
Затем пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Бумага Сравнительно простым и недорогим способом хранения бактерий является их высушнвание на полосках или дисках стерильной фильтровальной бумаги. Этот метод идеален для обеспечения контроля за качеством культур. В общей пробирке или в пузырьке с закручивающейся крышкой можно хранить много дисков, содержащих одну и ту же культуру. При необходимости диск достают стерильным пинцетом и в стерильных условиях вносят его в соответствующую жидкую среду.
Представителей ссм. Еп1сгоЬас1епасеае, а также многие другие бактерии можно сохранять на бумаге в течение нескольких лет. Техника этого метода заключается в следующем. Стерильную бумагу пропитывают суспензией бактерий, содержащей не менее 1О' клеток/мл, и высушивают на воздухе илн под вакуумом [21. Бактерии лучше выживают при высушивании под вакуумом. Полоски или диски бумаги хранят в запечатанных пробирках в зксикаторах или между листами стерильной прозрачной пластмассы 171 Если эксикаторы поместить в холодильник, то срок жизни культуры удлиняется.
516 12 хгйигиив микРООРглнизмов Желатина Многие гетеротрофные бактерии можно хранить в высушенных каплях или дисках желатины 1241. Обычно в таком виде бактерии лучше сохраняются при температуре — 20'С, чем при +4'С или при комнатной температуре. Желатиновые культуры готовят следующим образом. Культуры выращивают в соответствующих средах и клетки получают центрифугнрованием в стерильных условиях.
Осадок клеток ресуспендируют в малом количестве жидкой среды, переносят в пробирку с 2 — 5 мл расплавленной пищевой желатины и инкубируют при 30'С до достижения плотности 1О' — 10" клеток/мл, Затем с помощью стерильной пастеровской пипетки или шприца вводят каплю бактериальной суспензии на дно стерильной пластмассовой чашки Петри. Чашку Петри помещают в эксикатор, содержащий пятиокись фосфора, и откачивают из него воздух вакуумным насосом. После того как капли желатины высохнут, их переносят с соблюдением правил асептики в стерильные пробирки с завинчивающнмися крышками н хранят в холодильнике.
Культуру бактерий получают после переноса нселатиновой капли в стерильных условиях в пробирки, содержащие соответствующие среды. 12.2 МЕТОДЫ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ 12.2.1. Высушиванне из замороженного состояния Бысушнванне нз за лороженного состояния, или лнофнлизация, является одним из самых экономичных и эффективных методов длительного хранения бактерий и других микроорганизмов. При его использовании многие физиологически разнородные виды бактерий н бактериофагн удается сохранять в жизнеспособном состоянии ЗО лет и более.
Этим методом бактерии можно хранить небольшими порциями в ампулах. Сама процедура лиофнлнзацни достаточно проста, однако ее теоретические аспекты довольно сложны, н для более детального обсуждения мы отсылаем читателя к нескольким превосходным обзорам [1, 21, 22]. 517 часть и.
Рост Лиофилизация заключается в удалении воды из замороженных суспензий бактерий путем сублимации при низком давлении, т. е. при этом вода испаряется, минуя жидкую фазу. Высушенные клетки сохраняются довольно долго, если защитить их от действия кислорода, влаги и света. В любой момент клетки можно перевести в гидратированное исходное состояние, Лиофилизацию проводят разными способами с помощью различных приборов. Простейший из них представляет собой эксикатор, который охлаждают, чтобы клеточная суспензия во время подключения к вакуумному насосу оставалась в нем замороженной. Детали других способов лиофилизации и соответствующего оборудования описаны Уикерхэмом и Андреасеном [261, а также Хейнесом и др.
[1211. Наиболее широко используется лиофилизация с центрифугированнем и предварительное замораживание. Детальное описание метода лиофилизации с центрифугированнем можно найти в работах Маглптона [181, и Лапажа и др. [21. Оборудование Для лиофилизации существует как простое и недорогое оборудование, включающее систему эксикатора с вакуумным насосом, так и достаточно сложное, которое стоит тысячи долларов. Воспроизводимость н сохранность культур зависят от используемой системы. Однако часто очень хорошие результаты можно получить с помощью простой системы, состоящей из высоковакуумного насоса, конденсора и камеры, или распределительной гребенки (рис.
12.1 и 12.2). Ампулы Существуют ампулы самой разной формы и размеров; чаще других для лиофилизации используются два основных типа. Для клеток, лиофилизуемых в камере (рис. 12.1), рекомендуются двойные ампулы (рис. 12.3). Такими ампулами легче пользоваться, они менее подвержены загрязнению посторонними микроорганизмами и более надежны для хранения патогенных штаммов, чем 5!8 !З. ХРАНЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Рис. 12.1.
Лиофильная сушка с использованием двойных ампул. ! — вакуумный манометр; 2 — вакуумный насос; 8 — ионденсор типа У!г Т!з; 4 — резервуар, заполненный сухим льдом и этнлцеллосольвом; б — вакуумная прижимная крышка; б — стальной сосуд с измельченным сухим льдом и этилцеллосольвом; 7 — ампулы с образцами. Рис. 12.2. Лиофильная сушка с использованием одинарных ампул 1 — вакуумный манометр; 2 — вакуумный насос; 3 — конденсор типа здг Т!э; 4 — резервуар, заполненный сухим льдом н этилцеллосольвом, б — ампулы с образцами; б — стальной сосуд с измельченным сухим льдом и этнлцеллосольвом;? — гребенка.
обычные одинарные ампулы [25], которые сушат и закрывают непосредственно перед установкой в гребенку (рис. 12.2). Внутренний сосуд ампулы сделан из мягкого стекла (УФЙ Вс1еп(111с № 27921-015; 11,5Х35 мм). Подготовку ампул к работе проводят следующим образом. На дно наружного сосуда из мягкого стекла (У'гЧ)ч 5с(еп1111с б!й чАсть и. Рост № 27921-015' 14,25Х25 мм) помещают гранулы силикагеля (г!з)1ег 5с!еп!!!!с Со., № 42, 6 — 16 меш, сорт Те(- Та!е). Туда же кладут мау ленький кусочек ваты, что- бы предохранить от разби- 1;Р,: вания внутренний сосуд.
Перед работой наружные сосуды выдерживают при 100'С в течение ночи. В результате нагревания спликагель окрашивается в темно-синий цвет. При закрывании и хранении ампул цвет силикагеля не должен меняться. Для гребенки используются одинарные ампулы двух типов. Прн поверхностном замораживании культуры используют 1-милли- литровые шариковые ампулы в форме капли (фирма Коп!ез, наружный диаметр Ряс.!2.3. Двойяая ампула с высу1пеяным образцом. 1 — стек- 8 мм). При высушивании лявяая вата; а — ватная проб- осадка применяют 1-миллнк': 3 — наружная ампула' 4 — . тровые ампулы «Ед. внУтРеннЯЯ ампУла; б — лвофв- " бз» трубчатого типа лизоваяная культура; б — ватяая прокладка; 7 — сялякагсль, (Вс!!со Сз!азз, 1пс.) с на- ружным диаметром 8 мм.
Внутренние сосуды двойных ампул и одинарные ампулы в гребенке слегка прикрывают гигроскопической ватой и стерилизуют в течение 2 ч в сушильном шкафу при 170'С. Иногда вата содержит остатки масел и солей, которые, высвобождаясь в процессе нагревания, оставляют слабый налет на внутренних стенках ампул, токсичный для некоторых видов бактерий. Можно также стерилизовать ампулы автоклавированием в течение 1 ч; при этом их кладут на бок, чтобы внутрь легче проникал пар. Ампулы метят несмывающимися чернилами. Для 020 !В ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ этой цели рекомендуется пользоваться маркирующим прибором (Магйегп МасЫпе Со., тип 135А) и специальными чернилами (Магйегп МаОЫпс Со., № 7224).
Эти чернила выдерживают сверхнизкие температуры и кратковременное воздействие такого растворителя, как спирт. После маркировки ампулы нагревают в течение 20 мин в сушильном шкафу при 160'С для закрепления чернил. Подготовка культуры Успех лиофилизацни зависит от качества используемых клеток, от того, насколько они жизнеспособны и в каких условиях они выросли.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
