Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 101
Текст из файла (страница 101)
Выращивают достаточно большое количевтво клеток так, чтобы в суспензии содержалось не менее 1Оз клеток/мл. Клетки собирают в период максимальной стабильности и жизнеспособности культуры, т. е. в поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазах роста. Криопротекторы Для подготовки клеток к лиофилизацни нх суспендируют в среде, содержащей криопротекторы. Американская Коллекция типовых культур достигла успеха в длительном хранении физиологически различных бактерий, применяя в качестве криопротекторов либо 20е(е-ное сня.
тое молоко (при использовании двойных ампул), либо 24З7ь-ный раствор сахаровы, разведенный равным объемом ростовой среды (конечная концентрация саха- розы 127ь при использовании одинарных ампул). В других лабораториях в качестве криопротекторов используют декстран (10ь7Р), лошадиную сыворотку, инозит и др. 18, 14, 201. В случае использования двойных ампул применяют следующую процедуру. Готовят 20'/,-ное снятое молоко (Р1(со 0032) и стерилизуют его порциями (по 5 мл) в течение 20 мин при 116'С. Следует избегать перегрева, так как при этом может произойти карамелизация молока.
В стерильных условиях собирают клетки, выросшие на поверхности агара, смывая их 20~о-ным снятым молоком'. Клетки, выращенные в жидкой культуре, отделяют в стерильных условиях центрифугирова- 521 ЧАСТЬ !Ь РОСТ нием и затем суспеидируют осадок в стерильном молоке, так чтобы получилась суспензия, содержащая по меньшей мере 1О' клеток/мл. Эту же процедуру применяют и в том случае, когда в качестве криопротектора используется сахароза. В каждую двойную ампулу наливают 0,2 мл суспензии клеток, закрывают их ватными пробками и подравнивают пробки ножницами. После приготовления суспензии ее следует разливать по ампулам как можно быстрее.
Интервал между разливом и процессом лиофилизации должен быть сведен до минимума, чтобы избежать изменений в культуре. При использовании одинарных ампул в каждую из пих наливают 0,1 мл суспензия бактерий. Вставляют ватные пробки на глубину приблизительно 1,3 см ниже края ампулы и обжигают их верхнюю часть, чтобы убрать лишние волокна ваты, Лиофилизация с использованиел1 двойных ал1пул На рнс. 12.1 показана типичная система для лиофи лизации, в которой используются двойные ампулы.
Все вакуумные шланги сделаны из тайгона и имеют внутренний диаметр 0,9 см и толщину стенки 2,2 см. Система оснащена термисторным вакуумным измерительным прибором (Сопзо!1аа1еб 13асппщ Согр., модель С1Т 340А), с помощью которого можно измерять давление ниже 3 1О-з мм рт. ст. Когда прибор, измеряющий вакуум, помещают между кондснсором и вакуумным насосом, давление должно оставаться постоянным.
Если же его установить между камерой с ампулами и конденсором, то он будет регистрировать изменения давления пара в системе, и в частности подъем давления в момент начала высушивания. Однако после завершения процесса высушивания давление должно вновь опуститься ниже 3 10 з мм рт. ст. Внутренние ампулы с клетками помещают в вертикальном положении в сосуд из нержаве1ощей стали. Для лучшего высушивапия используют только один ряд ампул.
Чтобы заморозить клетки, сосуд с ампулами помещают ва 1 ч в морозильник с температурой от — 60 до — 65 'С. !2 хглнвние микгоогглнизмов Ловушкой для паров воды служит конденсор (ТЬе Иг!!з Со., 1пс.), куда кладут кусок сухого льда н наливают этилцеллосольв (Г!зпег Бс!еп1!1!с Со., Е-180). Кран между вакуумной крышкой А!шо-час (Ке(г1дега!!оп 1ог Бс!епсе, 1пс.) и конденсором закрывают и из системы откачивают воздух до тех пор, пока давление не опустится ниже 3 10 ' мм рт. ст. Через 1 ч сосуд из нержавеющей стали с ампулами помещают в большой неглубокий сосуд с колотым льдом, так чтобы лед окружал внутренний сосуд со всех сторон.
В таком положении сосуды оставляют на 2— 3 ч. Необходимо следить, чтобы сухой лед не попал в сосуд с ампулами. Внутренний сосуд накрывают вакуумной крышкой, которую до момента открывания крана придерживают рукой. Кран проверяют ва отсутствие утечки.
Высушивание проводят в вакууме 2 — 3 !О-з мм рт. ст. в течение !8 ч. Для удобства сушку можно начать во второй половине дня и завершить утром. Наружные ампулы с силикагелем извлекают из сушильного шкафа, помещают в сухой бокс с относительной влажностью <10'/, и дают им охладиться. Закрывают кран между вакуумной крышкой н коиденсором. Выходное отверстие в верхней части крышки присоединяют резиновой трубкой к колонке с силикагелем, помещенной внутри сухого бокса. Открывают вентиль выходного отверстия, чтобы сухой воздух из колонки с силикагелем вошел в сосуд с ампулами.
Ампулы переносят в сухой бокс и помещают каждую из них в наружную, сделанную из мягкого стекла. На ватную пробку во внутренней ампуле кладут кусочек бумаги (0,6 см) из стекловолокна (%йа!лап, 1пс.) (линии на рис. 12.3 соответствуют изгибам стекловолокна, а не его слоям). Двойные ампулы извлекают из сухого бокса и нагревают наружную ампулу на газовой горелке в том месте, где вставлена бумага из стекловолокна.
Ампулу вращают над горелкой до тех пор, пока стекло не начнет размягчаться. Его медленно вытягивают пинцетом до того момента, когда сужение в ампуле превращается в узкий капилляр. После охлаждения ампулы подсоединяют к вакуумному насосу с помощью резиновых пробок с отверстием, подходящим по размеру к открытому концу ампулы. 523 ЧАСТЬ П, РОСТ Воздух откачивают до тех пор, пока давление не снижается до 5.10-т мм рт. ст., и затем запаивают капиллярное сужение в пламени газовой горелки. Лиофилизация с использованием одинарных ампул Используя специальное натягивающее устройство, заполненные ампулы вставляют в гребенку (рис.
12.2) с помощью стерильных трубок из латекса янтарного цвета длиной 2,5 см (Атпеысап Нозр!(а! 5прр1у Согр., Мо !7610-063; 0,47ХО,!6 см). Когда используют ампулы типа «Е1(ччатЖ», суспеизню клеток замораживают, погружая ампулы в баню с этилцеллосольвом. Ампулы вращают в бане до образования ледяной корки, а затем закрепляют их в гребенке.
Ловушку для паров воды готовят так же, как описано в случае лиофилизации с использованием двойных ампул. Ампулы, помещенные в гребенку, остаются в бане из сухого льда с целлосольвом в течение всего процесса высушивания. Лиофилизацию проводят 18 ч в вакууме (3 10-т мм рт. ст. Во время процесса лиофилизации температура бани постепенно повышается; ее снижают, добавляя в наружный сосуд куски сухого льда.
По окончании высушивания ампулы запаивают ниже ватной пробки в пламени газовой горелки и дают им остыть. Хранение Культуры, лиофилизованные как в двойных, так и в одинарных ампулах, хранят при температуре ниже 5'С. Если культуры находятся в холодильнике типа Яечсо при — 30 или — 69'С, они сохраняются еще лучше. При комнатной температуре лиофилизованные культуры хранить нельзя. Восстановление культур из лиофилизованных клеток Сильно нагревают запаянный конец наружной ампулы на бунзеновской горелке и быстро капают на него 1 — 2 капли воды, чтобы горячее стекло треснуло. Осторожно, но быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку, а затем вытаскивают пробку из стекловолокна 524 ГК ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ и вынимают внутреннюю ампулу. Из последней аккурат.
ио удаляют ватную пробку, стараясь пе допустить загрязнения культуры попадающими извне волокнами. Прежде чем открыть одинарные ампулы, их надрезают трехгранной пилочкой на расстоянии около 2,5 см от верхнего конца, а затем дезинфицируют, протирая кусочком марли, пропитанной 70РР-иым спиртом. Обертывают ампулу стерильной марлей и обламывают надпиленный конец. Обычно это делают в вытяжном шкафу, а в случае патогенных бактерий — в специальном закрытом боксе. Перед тем как внести в ампулу жидкую среду, обломанный конец слегка обжигают.
Некоторые исследователи используют вольфрамовую иглу, нагретую в кислородно-газовой горелке до белого каления. Такой иглой им удается сделать в верхней части ампулы маленькое отверстие. Это обеспечивает более медленное проникновение воздуха в ампулу и стерильность пространства вокруг отверстия. Жидкую среду вносят в ампулу стерильным шприцем с иглой н извлекают суспензию бактерий им же. Лиофилизованную культуру переводят в суспензию сразу после вскрытия ампул, добавляя в каждую 0,3— 0,4 мл соответствующей стерильной жидкой среды. Суспензию в ампулах хорошо перемешивают и переносят в пробирки с 5 мл жидкой среды.
После тщательного перемсшивания отбирают 0,2 мл суспензии н наносят на твердую нли полужидкую среду того же состава. Необходимо проверять чистоту культуры до лиофилизации и после нее. Для этого суспепзию клеток стерильно разводят и делают посев штрихом иа твердые среды. Пробирки н чашки со средой инкубируют при оптимальной для бактерий температуре и, как только начинается их рост, делают пересев на свежую среду, чтобы убедиться в чистоте культуры.
Рост бактерий, подвергавшихся лиофилизации, часто начинается после длительной лаг-фазы. Поэтому нельзя делать заключение о гибели культуры, если иикубация была недостаточно длительной. Проверка жизнеспособности бактерий Чтобы определить, насколько эффективен процесс высушивания бактерий в замороженном состоянии, проверяют их жизнеспособность как до, так и после лиофи- члсть и. Рост лизации.
Кроме того, следует проводить периодические проверки, подтверждающие жизнеспособность хранящихся лиофилизованиых культур. Их желательно также проверять на случай появления каких-либо изменений в свойствах бактерий в результате их замораживания— высушивания или длительного хранения. 12.2.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
