Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 102
Текст из файла (страница 102)
Ультразамораживание Некоторые виды бактерий, не поддающихся лиофилизации, удается длительно сохранять в замороженном состоянии при температуре жидкого азота ( — !96'С) или в его парах ( — 150'С) в хорошо изолированных резервуарах. В Американской коллекции типовых культур успешно хранится таким способом множество «привередливых» бактерий, которые не утратили при этом свои фенотипичсские свойства в течение >15 лет.
Бактериальные культуры длительно сохраняются также в морозильниках с очень низкими температурами (например, в морозильнике типа Кечоа, 1пс. при — 70'С). Такой метод хранения вполне пригоден для многих бактерий. Однако при этом необходимо помнить, что иногда выключается электропитание сети или выходит из строя компрессор. В таких случаях потерю ценных коллекций помогают предотвратить сигналы предупреждения, а также запасные морозильники или электрические генераторы. Имеющиеся в настоящее время в продаже морозильники (папример, )хечсо, 1пс.) обычно оборудованы аварийной сигнальной системой, работающей на аккумуляторе. Рекомендуется также использование дополнительных систем предупреждения, таких, как звуковой, чувствительный к отключению напряжения датчик температуры (Агат Н.
Тпогпаз Со., № 4052-%20), работающий в интервале от — 75'С до 200'С (-~-0,3'С). Он работает от аккумулятора и может быть укреплен на стенке. Хранение в жидком азоте Считается, что использование жидкого азота для длительного хранения микроорганизмов обходится очень дорого.
Однако данные последних лет об успешном хра- 626 1Х ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ пении в жидком азоте физиологически разнородных бактерий свидетельствуют о том, что его использование рентабельно несмотря на высокую стоимость. Цена жидкого азота колеблется от 20 до 50 центов за 1 л. Имеется много холодильников, работающих на жидком азоте, различной конструкции и емкости, например типа МЪ'Е, Сгуодеп!сз, Ь(пде, 1)п!Оп СагЬ!де Согр. Их емкость варьирует от 10 до 1000 л, в них можно хранить от 300 до 40000 ампул. Ампулы Выпускаются различные виды ампул для хранения бактерий в жидком азоте. Особенно широко используются следующие типы: боросиликатные с толстыми стенками (1!!7Ьеа!Оп 3с!еп!!!!с, Сгуц1е № 12483 и 12523 с готовыми насечками) и специальные широкогорлые ампулы (%Ьеа!Оп, Оо!б Вапб Сей апб Т!Ззце Сгун1е № 12742).
Эти ампулы емкостью 1,2 мл имеют вдавления, облегчающие их вскрытие. Вместо стеклянных ампул можно использовать предварительно простерилизованвые полипропиленовые пробирки (38Х12,5 мм) с завинчивающимися крышками и силиконовыми прокладками (Чап8агб 1п1егпа!! оп а1) . Криопротекторы При хранении бактерий в жидком азоте применяют криопротскторы двух типов.
К первому относятся глицерин и диметилсульфоксид (ДМС), которые легко проходят через клеточную мембрану и обеспечивают как внутриклеточную, так и внсклеточную защиту от замораживания. Ко второму виду криопротекторов относятся такие вещества, как сахароза, лактоза, глюкоза, маннит, сорбит, декстран, поливинилпирролидон и полигликоль, которые обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны. Протекторы первого типа, т.
е. глицерин и ДМС, оказались более эффективными и пригодными для широкого круга бактерий. Выбор криопротектора зависит от вида бактерий. При замораживании новых штаммов следует предварительно проверить действие на них криопротектора. 527 ЧАСТЬ 44. РОСТ Глицерин н ДМС обычно добавляют в ростовую среду в концентрации 10 и 5ь/, (объем/объем) соответственно. Глицерин стерилизуют автоклавированием 15 мин при 104 Па.
Стерилизацию ДМС осуществляют фильтрованием, используя пористые свечи Села с размером пор 03. ДМС собирают порциями по 1Π— 15 мл в стерильныс пробир. ки и хранят в замороженном состоянии при 5'С (ДМС замерзает при !8'С). Из-за накопления продуктов окислительного распада ДМС в открытых бутылях хранят не более 1 мес. Подготовка культуры В выживании бактерий после замораживания жидким азотом важную роль играет физиологическое состояние культуры.
В основном в замороженном состоянии хранят активно растущие клетки из культур в середине или в конце зкспоненциальной фазы роста (231. Клетки выращивают в соответствующей среде. В случае жидких культур клетки отделяют в стерильных условиях цеитрифугированием и ресуспендируют осадок в стерильной свежей среде, содержащей или 10% (объем/ объем) глицерина (готовят добавлением 20%-ного глицерина к равному объему стерильной среды), или 5% (объем/объем) ДМС (приготовленного добавлением соответствующего количества 100%-ного ДМС к стерильной среде).
В случае роста культур на агаре клетки смывают с его поверхности стерильной жидкой средой, содержащей подходящий криопротектор, и разливают в стерильные маркированные ампулы по 0,4 мл суспензии, содержащей не менее 10' клеток/мл. Если штамм является патогенным, ватную пробку срезают на уровне верхнего конца ампулы и хранят ампулы в парах жидкого азота нсзапаянными. Это делают во избежание несчастных случаев в процессе их запаивания или во избежание взрывов в процессе оттаивания (из-за попадания в ампулу жидкого азота через мелкие отверстия и последующего быстрого выхода газа при комнатной температуре).
В случае непатогснных бактерий ампулу перед запаиванием охлаждают при 4'С не менее 30 мин. Затем 528 М ХРЛНЕНИЕ МИКРООРГЛНИЗМОВ ее нагревают над местом круговой насечки (надрезом) стекла, вращая в пламени в течение нескольких секунд, чтобы удалить влагу. Эта процедура позволяет избежать увеличения давления внутри ампулы, которое может привести к появлению пузырей в процессе ее запаивания. Перед запаиванием из ампулы извлекают часть ватной пробки. Желательно запаивать ампулы с помощью оборудованного кислородно-газовой горелкой полуавтоматического устройства !например, КаЬ)епЬегд-О!оЬе Еац!раен! Со.), предназначенного для вытягивания и запаивания стекла.
Считается, что в этом случае гарантируется минимум мелких капиллярных пор. Осторожно пинцетом горячую ампулу ставят в штатив, погруженный в баню с холодной водой, с таким расчетом, чтобы она была погружена на глубину 0,6 см. Нельзя допускать попадания воды на горячую часть ампулы, иначе стекло может треснуть. После охлаждения ампулы готовы к замораживанию. Если все операции были выполнены удовлетворительно, температура содержимого в ампулах не должна подниматься выше 25'С. В отсутствие автоматического устройства ампулы запаивают вручную на газовой горелке, но их необходимо при этом проверять на герметичность. С этой целью ампулы после запаивания оставляют на 30 мин при 5'С в 0,05%-ном растворе метиленового синего.
Плохо запаянные ампулы обнаруживают по проникновению в них краски. Замораживание Опубликовано много работ о влиянии скорости охлаждения в процессе замораживания на выживание бактерий 14, 151 Наилучшие результаты по выживанию и восстановлению бактериальных культур были получены в случае медленного охлаждения клеток, например со скоростью 1 ' С/м ин. Медленного охлаждения достигают следующим образом: 1. Ампулы с культурой помещают в алюминиевые банки 1к1азсо № А545), которые вставляют в картонные коробки 1Мнггау апд Не!В1ег, 1пс.) с прямоугольными отверстиям и 6,4 Х 27,9 см.
2. Коробки ставят в морозильную камеру ввтомати- ЧАСТЬ П, РОСТ ческого низкотемпературного холодильника (()п)оп Саг516е Согр., 1(яде ВЕЗ-2) и устанавливают определенную скорость охлаждения. 3. Замораживают клетки при контролируемой скорости охлаждения 1'С/мнн до — ЗО'С, а затем при значительно большей скорости (15 — ЗО'С/мин) до — 150'С.
4. После достижения этой температуры ампулы переносят в сосуд с жидким азотом и хранят в нем при — 196'С или в парах азота ( — 150'С). Если нет автоматического холодильника с программой, медленное охлаждение может быть достигнуто с помощью одного из следующих приемов; 1. Стеклянные или пластмассовые ампулы с культурой в лотке из нержавеющей стали помещают на дно морозильника Кечсо па 1 ч при температуре — 60'С, а затем погружают их на 5 мин в баню с жидким азотом.
Скорость охлаждения до — 60'С при этом составляет приблизительно 1,5'С/мнн. 2. Рекомендуется также погружать поставленные в банки запаянные ампулы в градуированный цилиндр с 95о/о-ным этиловым спиртом [6]. Цилиндр с ампулами помегцают в морозильник Кечсо при — 85'С, чтобы содержимое ампул охладнлось до этой температуры, а затем банки с ампулами помещают в жидкий азот. Оттаивание Обнаружено, что быстрое нагревание замороженных микроорганизмов или спор приводит к их быстрому восстановлению (оживлению) 19, 14, 16, 171 Подобные испытания были проведены с замороженными клетками бактерий из Американской коллекции типовых культур.
Чтобы оживить замороженные культуры, нх быстро оттаивают в водяной бане при 37'С и слабом встряхивании, пока не растает весь лед. В случае стеклянных ампул для этого обычно требуется 40 — 60 с, а в случае полипропиленовых — 60 — 120 с. Сразу же после оттаивания ампулу извлекают из водяной бани и дезинфициРУют ее 70о/о-ным этаполом. АмпУлУ вскРывают и в стерильных условиях переносят культуру в свежую среду.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
