Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 82
Текст из файла (страница 82)
10.11, А), в непрерывном режиме в обеих системах (рис. 10.1!,Б) или в двух комбинациях этих режимов (рис. 10.11, В, Г). Основным условием эффективной работы таких систем является подходящее устройство для диализа. Такое устройство, напоминающее рамный фильтр-пресс, содержит сепараторы из силиконовой резины, которые способ. ствуют созданию турбулентных потоков культуры и дмзлизата по разные стороны от мембран [511. Для атих целей используют также различные типы гемодьализаторов. 422 !о жидкАя культуРА Зи ре нее, ра Рис. 10.12. Схема системы дизлизного проточного культивирования в ферментере с подпиткой.
Для мзксимзльного удаления токсичных продуктов метзболизмз в дизлизной системе используется поток воды [1о) ! ! иа! з зг, Рт, хг, йе Система с Зиализам Система !Рермеитера Математическое моделирование и применение ЭВМ На примере описанных выше систем и практического использования проточного культивирования с диализом мы обсудим значение математического моделирования и расчетов на ЭВМ для предсказания результатов, которые можно получить при культивировании бактерий.
Для подтверждения теоретических предсказаний прово- 423 Готовую систему можно приспособить к используемой культуре. Так, прн лимитировании роста бактерий токсичными метаболнтами (например, молочной кислотой) наиболее эффективно работает полностью проточная система (рис.
10.12). Непосредственно в ферментер субСтРат (Эи1) ПОДаЮт В ДОВОЛЬНО ВЫСОКОЙ КОНЦЕНтРаЦИИ, и поэтому потребность в обычном сосуде для диализата отпадает. Диалнзная система в данном случае состоит только из шлангов, насоса и диализной части диализатора и имеет относительно небольшой объем (Уа).
В систему поступает только вода с довольно высокой скоростью (га). Такая система обеспечивает максимально возможный для диалнза концентрационный градиент. Стайбер н др. 1541 применили ее в своей работе и показали максимальное превращение концентрированной (25%) лактозы в молочную кислоту. члсть 1! Рост Рис. 10.13. Влияние времени задержки клеток (Тг) ня остаточное содержание ляктозы в ферментере ог и диялизной системе Зз в процес. се проточного дизлизного культивирования.
Кривые получены путем расчетов мз. тематической модели ня ЗВМ; точки взяты из экспериментзльиых денных с целью продемонстрировзть хороюее соответствие между результатами и теоретическими предсказаниями [оо1. О 3 г дят лабораторные опыты, изменяя лишь некоторые экспериментальные условия в заранее выбранных критических точках, В свою очередь экспериментальные результаты используются для установления констант роста и для того, чтобы подтвердить необходимость в дополнительных членах в уравнениях.
Основываясь на успешных теоретических предсказаниях и экспериментальных подтверждениях, модель становится значительно более точной и может быть полезна при управлении процессом культивирования. Примером такого сочетания теоретического и экспериментального подхода к бактериальному процессу могут служить данные Стайбера и др. 115, 54, 551, полученные при культивировании бактерий в среде с лактатом и аммонием. Для субстрата, продукта и биомассы в ферментере и диализной замкнутой системе были выведены уравнения материального баланса и скоростей соотношения реакций.
Эти уравнения объединили, опрсде- 424 м жидкля хтльттгх лили в них переменные в безразмерной форме, а производные по времени приравняли к нулю, чтобы получить общее решение для состояния равновесия, которое описывается пятью квадратными уравнениями. Реальные величины для варьируемых членов были введены в программу для вычислительной машины. При сравнении смоделированных предсказаний с экспериментальными данными (рис. 10.13) была получена хорошая корреляция. Такая методология, сочетающая теоретические предсказания и экспериментальныс подтверждения, широко используется в промышленных микробиологических процессах, но в других областях бактериологии она почти не применяется.
Этот важный метод следует значительно более широко применять в научных исследованиях, например для предсказания исхода инфекционных заболеваний. 1О.ЗЛ. Ферментеры с иммобилизованными клетками (Ф. Герхардт) Большинство методов бактериальных культур предназначено для максимального размножения клеток, и основная масса питательных компонентов идет на поддержание их роста. Однако в промышленных ферментационных процессах часто необходимо получать максимальные количества определенных метаболитов, и поэтому желательно, чтобы питательные компоненты среды расходовались не для роста бактерий, а для образования ими требуемого продукта.
В последнее десятилетие огромное количество исследований направлено на использование бактериальных ферментов или целых клеток, «иммобилизованных» в ферментере, с целью максимально возможного превращения субстрата в необходимый продукт. Аббот [61 рассматривает иммобилизацию клеток как «физическую локализацию микроорганизмов, позволяющую повторно и экономно их использовать». Можно также определить ферментер с иммобилизованными клетками как устройство, обеспечивающее условия, в которых метаболизм поддержания достигает своего максимума, а рост сводится к минимуму. Проиллюстрируем этот принцип на примере давно 425 ЧАСТЬ Н РОСТ известного чскорого способа образования уксуса», при котором колонии уксуснокислых бактерий в виде пленки находятся в иммобилизованном состоянии на деревянных стружках, заполняющих колонку.
Сверху в такую колонку подают этанол, а снизу вверх — воздух, обеспечивающий синтез уксусной кислоты. После образования бактериальной пленки в дальнейшем она почти не растет, тогда как жизнеспособность бактерий поддерживается за счет окисления этанола в ацетат. Такой процесс может продолжаться непрерывно в течение недель или месяцев. Одним из главных мстодов иммобилизации клеток остается их физическое прикрепление или химическое связывание с твердым носителем, в то время как для образования скоплений клеток используются другие методы. Детальное описание методов иммобилизации клеток в ферментерах не входит в задачи этой книги; по этому вопросу существует несколько обзоров 10, 7, !31.
10.4. СБОР И ОЧИСТКА Выбор способа отделения бактериальных клеток от среды культивирования определяется тем, как в дальнейшем будут использоваться фракции. Так, если собираются изучать клетки, то их отделение путем фильтрования нежелательно, поскольку при этом клетки могут загрязниться материалом, имеющимся в фильтре. Если же будут исследовать культуральную жидкость, то после центрифугирования культуры рекомендуется отбрасывать часть надосадочной жидкости, чтобы избежать рссуспендирования клеточного осадка при ес удалении. 10.4.1. Фильтрация Осадочная фильтрация Для получения бактериальных клеток из культуральной среды существуют два типа фильтрации: осадочная и мембранная. Для осадочной фильтрации используют высокопористые материалы.
Обычно фильтрующая система состоит из подложки фильтра (фильтровальной бу- М ЖИДКАЯ КУЛЪТУРА маги или ткани с довольно большим диаметром пор) и толстого нанесенного сверху слоя фильтрующего материала (целлюлозы, диатомовой земли, кизельгура и др.), который легко суспендирустся в водных средах с образованием пористого осадка, задерживающего бактерии 1571 При использовании фильтруюшего материала увеличивается эффективная поверхностная зона фильтра и соответственно количество бактерий, задерживаемых одним фильтром. Фильтрующий материал можно добавлять непосредственно в культуральную среду или предварительно наслаивать на подложку фильтра. На практике добавление фильтрующего материала, такого, как целлюлоза, в культуральную среду позволяет профильтровать в 10 раз больше жидкости, чем при предварительном нанесении того же количества целлюлозы на подложку фильтра. Однако при таком добавлении значительно возрастают трудности, связанные с извлечением клеток для последующих исследований.
Осадочное фильтрование проводят на воронке Вюхнера. Ее укрепляют в вакуумной колбе и выстилают высокопористой фнльтровальной бумагой (например, ватман )ЧЯ 1). Включают вакуумный насос и на бумагу осторожно и равномерно наливают предварительно приготовленную суспензию кальцифицированной диатомовой земли, так чтобы образовался слой толщиной 2— 5 мм. Поскольку через такой слой фильтрация происходит равномерно, бактерии можно удалять по мере накопления, соскабливая их с поверхности фильтра.
Это позволяет проводить довольно длительное фильтрование без замены фильтра. При осадочной фильтрации нз культуральной среды удаляется большинство микроорганизмов, в результате чего получа|от хорошо просветленный фнльтрат. Однако для стерилизации жидких сред этот метод неприменим. Клетки, полученные осадочной фильтрацией, обычно загрязнены болыпим количеством фильтрующего материала, который может помешать их дальнейшему изучению.
Мембранная фильтрация В отличие от осадочной мембранная фильтрация основана не на использовании глубоких или извилистых пор фильтрующего материала, а на задержке бактерий 427 ЧАСТЬ и. РОСТ на его поверхности. Бактерии не способны проходить через поры мембраны, диаметр которых изменяется в очень узких пределах. На практике при мембранной фильтрации требуется дополнительное давление на фильтр. Аппараты для мембранной фильтрации и мембранные фильтры с различными размерами пор имеются в продаже (М1йроге Согр., 1чпс!еороге Согр., Се1тап ЗС1епсез, 1пс.).
Выбор мембраны зависит от характеристик культуры и от того, что необходимо получить — клетки или филь- трат. Поскольку средний размер клеток бактерий равен приблизительно 0,5 — 1,5 мкм, для их полного удаления в случае стерилизации фильтрованием требуется микро- пористый мембранный фильтр с размером пор менее 0,5 мкм. Для стерилизации фильтрованием часто используют мембраны с диаметром пор 0,22-~-0,02 мкм. Такие мембраны подходят для большинства методов стерилизации, но из-за того, что бактерии обладают достаточной гибкостью, теоретически можно допустить, чтс они способны проходить через них. Поэтому растворы, стерилизованные фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, следует периодически проверять на стерильность. Использование мелкопористых мембранных фильтров со средним размером пор 0,45-~-0,04 мкм в принципе позволяет быстро и эффективно фильтровать бактериальные культуры, но не обеспечивает стерильности фильтрата.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
