1612729234-f204a36a1e721af405194e29352ad3c1 (827564), страница 21

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 21)

Контрольные вопросы

1. Реактив Фентона.

2. Механизм реакции разложения пероксида водорода в водном растворе, содержащем ионы Fe²⁺ и Fe³⁺.

3. Проанализируйте механизм реакции разложения пероксида водорода в водном растворе, используя квазистационарное приближение.

4. Схема установки, использующей принцип измерения давле-ния выделившегося газа.

5. Методы определения порядка реакции.

6. Предложите метод нахождения константы скорости реакции первого порядка, не требующий определения давления выде-лившегося кислорода после завершения реакции.

7. Примеры применения пероксида водорода в химических процессах и в производстве.

8. Схема установки, использующей принцип измерения объёма выделившегося газа.

9. Что такое цеолит?

10. В каких случаях гетерогенные железосодержащие катализа-торы имеют преимущества над гомогенным реактивом Фентона? Что это за преимущества?

Библиографический список к работе К-18

1. Fenton H. J. H. Oxidation of tartaric acid in presence of iron // J. Chem. Soc., Trans. 1894. N. 65. P. 899–911.

2. Сычев А. Я., Исак В. Г. Соединения железа и механизмы гомогенного катализа активации O₂, H₂O₂ и окисления органических субстратов // Успехи химии. 1995. Т. 64. № 12. С. 1183–1209.

3. Елизарова Г. Л., Матвиенко Л. Г., Пармон В. Н. Гидроксиды железа – новые катализаторы окислительных реакций в водных растворах // Кинетика и катализ. 2000. Т. 41. C. 839–845.

4. Kaizer J., Klinker E., Oh Na Y. et. al. Stable nonheme FeIVO complexes that can oxidize C-H bonds of cyclohexane at room temperature // J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126. P. 472–473.

5. Сычёв А. Я., Исак В. Г. Гомогенный катализ соединениями железа. Кишинев: Штиинца, 1988.

6. Ho H. N., Kim C. W., Jeong K. H., Hwa K. G., Han K. S., Bong H. S., Seff K. Detailed determination of the Tl (+) positions in zeolite Tl-ZSM-5. Single-crystal structures of fully dehydrated Tl-ZSM-5 and H-ZSM-5 (MFI, Si/Al = 29). Additional evidence for a nonrandom distribution of framework aluminum // J. Phys. Chem., Am. Chem. Soc. 2009. V. 113. P. 19937–19956.

7. КИНЕТИКА РЕАКЦИЙ С УЧАСТИЕМ ФЕРМЕНТОВ

7.1. Уравнение Михаэлиса – Ментен

Ферменты как природные катализаторы многочисленных химических превращений, происходящих в живой клетке, обладают уникальными свойствами, прежде всего высокой хемо-, регио-, стереоспецифичностью по отношению к субстрату и типу реакции. Ферментативные реакции протекают в водных средах в мягких условиях при температурах ниже 100 С и при нейтральных значе- ниях рН. Ферменты катализируют превращение либо D-, либо L-изомера субстрата. Например, в рацемической смеси аминокислот фермент аминоацилаза гидролизует только производные L-аминокислот. В продуктах ферментативной реакции содержание одного из энантиомеров (R- или S-; D- или L-) может достигать 99,5 %. Именно регио- и стереоспецифичность биокатализа является его главным отличием от традиционного химического катализа.

Схема простейшей односубстратной ферментативной реакции может быть представлена в виде

где E – фермент, S – субстрат, ES – фермент-субстратный комплекс, P – продукт реакции. Эту схему можно анализировать в квазиравновесном или квазистационарном приближении [1–3]. Оба подхода приводят к уравнению для скорости реакции, называемому уравнением Михаэлиса – Ментен:

(7.1)

где W – начальная скорость реакции, [E₀] – общая концентрация фермента, [S] – начальная концентрация субстрата, K_M – комбинация констант k₁, k_–1 и k₂, называемая константой Михаэлиса.

7.2. Окисление углеводов кислородом под действием глюкозооксидазы

Глюкоза – моносахарид, относящийся к группе альдогексоз. В природе встречается только D-глюкоза, которая в водных растворах находится в виде смеси двух аномеров:  (36 %) и β (64 %). Самый устойчивый таутомер – β-D-глюкоза в конформации кресла.

В крови человека содержится ряд углеводов, из которых глюкоза является самым важным.

Глюкозооксидаза (D-глюкозо-1-оксидаза) – фермент, окисляющий β-D-глюкозу молекулярным кислородом до глюконо-1,5-лактона. При этом образуется перекись водорода [4].

Молекула глюкозооксидазы имеет четвертичную структуру и состоит либо из 2, либо из 4 субъединиц в зависимости от источника его выделения (бактерии, плесень). Каждая субъединица содержит одну молекулу прочно связанного кофермента – флавин-аденин динуклеотида (ФАД), непосредственно участвующего в окислительно-восстановительных превращениях субстратов – глюкозы и кислорода.

В процессе реакции ФАД (окисленная форма) принимает два электрона и два протона и восстанавливается до ФАД-H₂. При взаимодействии ФАД-H₂ с молекулярным кислородом образуется перекись водорода и ФАД в окисленной форме.

Реакция окисления -D-глюкозы в глюконо-1,5-лактон под действием глюкозооксидазы протекает с высокой скоростью при комнатной температуре:

Образовавшийся глюконо-1,5-лактон в водном растворе самопроизвольно гидролизуется с образованием глюконовой кислоты:

Ферментативная реакция протекает по «пинг-понг»-механизму, т. е. стадийно с последовательным присоединением сначала первого субстрата (глюкозы), затем второго субстрата (кислорода), без образования тройного фермент-субстратного комплекса.

Д

ействие глюкозооксидазы можно представить следующей кинетической схемой:

где S – глюкоза, P₁ – глюконолактон, E_ox – фермент с окисленной формой ко-фермента, E_red – фермент с восстановленной формой ко-фермента. Для облегчения анализа можно несколько упростить эту схему:

При стационарном протекании реакции W₃ = W₅:

Предположим, что первая стадия является равновесной. Тогда общая концентрация фермента равна

Скорость реакции равна скорости образования продукта P:

При и имеем соответственно

Если принять концентрацию O₂ постоянной, то оба уравнения по форме совпадают с классическим уравнением Михаэлиса – Ментен для односубстратной реакции (7.1).

Предложенные в практикуме лабораторные работы по ферментативному катализу посвящены исследованию специфических свойств ферментов и кинетики их действия на примере изучения реакции окисления глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозооксидазы.

7.3. Лабораторные работы

7.3.1. Работа К-19. Изучение специфичности действия глюкозооксидазы. (Спектрофотометрия)

Целью работы является изучение одного из уникальных свойств ферментативного катализа – специфичности фермента по отношению к субстрату. Благодаря этому свойству ферменты широко используются в аналитической химии для селективного определения важных метаболитов в многокомпонентных средах. Например, глюкозооксидаза применяется в клинических анализах для определения содержания глюкозы в крови. При ферментативном окислении глюкозы образуется эквивалентное количество перекиси, которая может определяться йодометрически. В современных глюкометрах образовавшаяся перекись водорода под действием фермента пероксидазы окисляет органические соединения (4-аминоантипирин, N,N-дизамещённый анилин) с образованием окрашенных продуктов [5]. Измерение концентрации глюкозы в крови занимает всего несколько секунд.

Для определения специфичности фермента глюкозооксидазы используют набор углеводов (глюкозу, маннозу, галактозу) и сравнивают скорости ферментативного окисления этих субстратов растворённым кислородом из воздуха.

Экспериментальная часть

Необходимое оборудование и материалы

– мерная колба на 250 мл – 1 шт.;

– стакан на 200 мл – 1 шт.;

– стаканчики на 25 мл – 4 шт.;

– рН-метр;

– спектрофотометр “Cary 50” или аналогичный, кварцевая кювета толщиной 1 см;

– автоматические микропипетки на 5 и 10 мкл;

– набор углеводов;

– 9 %-й раствор молибдата натрия;

– калий фосфорнокислый однозамещённый;

– 0,1 N раствор NaOH;

– калий йодистый;

– раствор глюкозооксидазы (хранится в холодильнике);

– стандартный раствор с рН = 6,86 для калибровки рН-метра.

Рабочий раствор для измерения скорости ферментативной реакции готовят непосредственно в кювете спектрофотометра. Для этого в кювете смешивают приготовленные заранее реагенты (KI-реактив, раствор углевода, буфер), термостатируют до нужной температуры. Реакцию начинают добавлением фермента, немедленно интенсивно перемешивают и записывают кинетическую кривую. Регистрация длится 1–5 мин в зависимости от количества добавленного фермента. Порядок выполнения работы показан в учебном видеофильме к данной работе. Каждый эксперимент воспроизводят 2–3 раза.

Приготовление 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,0

Провести проверку рН-метра по стандартному раствору с рН = 6,86 при 25 °С.

1,71 г калия фосфорнокислого однозамещённого растворить в диcтиллированной воде в стакане объёмом 200 мл. С помощью раствора NaOH довести величину рН буферного раствора до значения 6,0. Перенести содержимое стакана в мерную колбу на 250 мл, довести до метки дистиллированной водой.

Приготовление KI-реактива

0,83 г калия йодистого растворить в 8 мл буферного раствора рН 6,0, добавить 2 мл 9 %-го раствора молибдата натрия, перемешать. KI-реактив должен быть свежеприготовленным и использоваться в течение одного занятия.

Приготовление 10 %-х растворов углеводов

0,5 г углевода растворить в 5 мл буферного раствора рН 6,0.

Выполнение работы

Характеристики

Список файлов лабораторной работы