1612729234-f204a36a1e721af405194e29352ad3c1 (827564), страница 22

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 22)

Запись кинетических кривых проводят на спектрофотометре “Cary 50” на длине волны  = 350 нм. Порядок работы со спектрофотометром показан в видеофильме к данной работе. Опыты проводят при комнатной температуре.

В кварцевую кювету длиной 1 см помещают:

– 0,4 мл 10 %-го раствора углевода;

– 0,5 мл KI-реактива;

– 1,1 мл буферного раствора рН 6,0.

Общий объём раствора в кювете 2 мл, начальная концентрация углевода – 2 %.

Автоматической микропипеткой вносят 5 или 10 мкл раствора фермента, интенсивно перемешивают и записывают кинетическую кривую. Опыт воспроизводят 2–3 раза.

Выделившаяся в результате ферментативной реакции перекись водорода взаимодействует с KI-реактивом:

Н₂О₂ + 3I^– + 2Н⁺  2Н₂О + I₃^–.

В результате образуется I₃^–, который обладает интенсивным поглощением в ближней УФ-области. В максимуме линии поглощения при 350 нм коэффициент экстинкции  = 2,510⁴ лмоль^–1см^–1.

Результаты записывают в табл. 7.1.

Таблица 7.1

Результаты измерений

На основании полученных данных делают вывод о специфичности действия глюкозооксидазы.

Отчёт о работе К-19 должен содержать:

– дату выполнения работы;

– название спектрофотометра;

– сведения об условиях протекания ферментативной реакции: значение рН, температура, начальная концентрация углеводов, объём добавляемого раствора фермента;

– первичные экспериментальные данные в виде табл.7.1;

– вывод о специфичности действия глюкозооксидазы.

7.3.2. Работа К-20. Определение кинетических параметров ферментативного окисления глюкозы кислородом под действием глюкозооксидазы. (Спектрофотометрия)

Целью работы является определение константы Михаэлиса K_M и максимальной скорости W_max реакции окисления глюкозы кислородом под действием фермента глюкозооксидазы. При обработке данных используется уравнение Михаэлиса – Ментен (7.1):

где W – начальная скорость ферментативной реакции, мольл^–1с^–1; W_max – максимальная скорость реакции; K_M – константа Михаэлиса, моль/л; [S] – концентрация субстрата (глюкозы), моль/л. Концентрация растворённого кислорода в равновесии с воздухом составляет 0,24 мМ при 25 С. За время проведения опыта концентрация O₂ меняется незначительно, однако скорость реакции следует измерять на начальном участке кинетической кривой.

Экспериментальная часть

Необходимое оборудование и материалы

– мерная колба на 250 мл – 1 шт.;

– стакан на 200 мл – 1 шт.;

– -D-глюкоза;

– 9 %-й раствор молибдата натрия;

– калий фосфорнокислый однозамещённый;

– 0,1 N раствор NaOH;

– калий йодистый;

– раствор глюкозооксидазы (хранить в холодильнике).

– спектрофотометр “Cary 50”, кварцевая кювета толщиной 1 см;

– рН-метр;

– автоматические микропипетки на 5, 10 и 200 мкл.

Измерение скорости ферментативной реакции проводят при комнатной температуре. Непосредственно в кювете спектрофотометра смешивают заранее приготовленные реагенты (KI-реактив, раствор глюкозы, буфер). Реакцию начинают добавлением фермента (5 или 10 мкл), немедленно интенсивно перемешивают и записывают кинетическую кривую. Регистрация длится 1–5 мин в зависимости от количества добавленного фермента. Каждый эксперимент воспроизводят не менее трёх раз.

Приготовление 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,0

Провести поверку рН-метра по стандартному раствору с рН 6,86 при 25 °С.

1,71 г калия фосфорнокислого однозамещённого растворить в диcтиллированной воде в стакане объёмом 200 мл. С помощью раствора NaOH довести рН полученного раствора до значения 6,0. Перенести содержимое стакана в мерную колбу на 250 мл, довести до метки дистиллированной водой.

Приготовление KI-реактива

0,83 г калия йодистого растворить в 8 мл буферного раствора рН 6,0, добавить 2 мл 9 %-го раствора молибдата натрия, перемешать. KI-реактив должен быть свежеприготовленным и использоваться в течение одного занятия.

Приготовление 10 %-го раствора глюкозы

1 г D-глюкозы растворить в 10 мл буферного раствора рН 6,0, выдержать не менее 2 часов для протекания реакции мутаротации с образованием смеси - и -D-глюкозы.

Выполнение работы

Запись кинетических кривых проводят при комнатной температуре на длине волны  = 350 нм.

В кварцевую кювету толщиной 1 см помещают 0,5 мл KI-реак-тива, затем добавляют следующие объёмы 10 %-го раствора глюкозы и буферного раствора рН 6,0.

Автоматической микропипеткой вносят 5 или 10 мкл раствора глюкозооксидазы, интенсивно перемешивают и записывают кинетическую кривую. Опыт воспроизводят не менее трёх раз. Плохая воспроизводимость обычно означает отсутствие навыков работы с микропипеткой. Обратитесь за помощью к преподавателю.

Обработка экспериментальных данных

По кинетическим кривым «оптическая плотность – время» определяют начальную скорость окисления глюкозы W₀, равную скорости выделения перекиси водорода в ферментативной реакции. Концентрацию перекиси водорода, в свою очередь, определяют по реакции с KI-реактивом, в результате которой образуется I₃^–, имеющий максимум поглощения при 350 нм и коэффициент экстинции  = 2,510⁴ лмоль^–1см^–1.

Н₂О₂ + 3I^– + 2Н⁺  2Н₂О + I₃^–.

Начальная скорость реакции в единицах [моль H₂O₂ в 1 мин на 1 мкл раствора глюкозооксидазы] измеряется по начальному участку кинетической кривой, когда концентрацию растворённого кислорода можно считать приблизительно постоянной.

Строят график зависимости скорости реакции от времени, экстраполяцией к t = 0 определяют начальную скорость.

Затем строят график зависимости начальной скорости реакции W₀, от начальной концентрации глюкозы в растворе [S₀]. Обработку экспериментальных данных проводят графически в координатах Лайнувера – Берка: 1/W₀ — 1/[S₀] и Корниш – Боуден: W₀ — W₀/[S₀]:

(7.2)

(7.3)

Из полученных графиков вычисляют константу Михаэлиса для глюкозы K_M и максимальную скорость реакции W_max.

Отчёт о работе К-20 должен содержать:

– дату выполнения работы;

– графики, по которым определяли значения константы Михаэлиса и найденные значение K_M и максимальной скорости реакции W_max;

– название спектрофотометра;

– сведения об условиях протекания ферментативной реакции: значение рН, температура, начальная концентрация глюкозы, объём добавляемого раствора фермента;

– первичные экспериментальные данные (график зависимости W₀ — [S₀]).

Контрольные вопросы

1. Катализ. Ферментативный катализ и его характерные отличия от традиционного химического катализа.

2. Приближённые методы решения системы кинетических уравнений сложной реакции.

3. Квазиравновесное и квазистационарное приближения.

4. Решите систему кинетических уравнений реакции окисления глюкозы в квазистационарном приближении.

5. Уравнение Михаэлиса – Ментен. Решите систему кинетических уравнений простейшей односубстратной ферментативной реакции в квазистационарном приближении.

6. Решите систему кинетических уравнений простейшей односубстратной ферментативной реакции в квазиравновесном приближении.

7. Какова размерность константы Михаэлиса? Каков её смысл?

8. Анаморфозы для расчёта K_M и максимальной скорости реакции W_max.

9. Оцените изменение концентрации кислорода в реакционной среде за время записи кинетической кривой. Растворимость кислорода в воде указана выше.

10. Принципиальная схема однолучевого спектрофотометра.

Библиографический список

1. Березин И. В., Клёсов А. А. Практический курс ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976.

2. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики М.: Мир, 1979. 280 с.

3. Галимова М. Х. Ферментативная кинетика: Справочник по механизмам реакций. М.: КомКнига, 2007.

4. Гулый М. Ф., Билай В. И. и др. Фермент глюкозооксидаза и его применение. Киев: Наукова Думка, 1964.

5. Heinzerling P., Schrader F., Schanze S. Measurement of Enzyme Kinetics by Use of a Blood Glucometer: Hydrolysis of Sucrose and Lactose // J. Chem. Educ. Vol. 89. P. 1582−1586, 2012.

8. Гетерогенный катализ в проточном реакторе

8.1. Каталитическая реакция в открытой системе

Катализ – это изменение скорости химической реакции под влиянием веществ – катализаторов, многократно вступающих в промежуточное химическое взаимодействие с участниками реакции и восстанавливающих свой химический состав после каждого цикла промежуточных взаимодействий. Если система состоит из несколько фаз, а реагирующие вещества и катализатор находятся в разных фазах, мы имеем дело с гетерогенным катализом. Катализаторы могут увеличивать скорости химических реакций и направлять химические превращения в сторону образования одного из термодинамически возможных продуктов за счёт того, что скорости различных реакций ускоряются катализаторами в различной степени. Например, разложение изопропанола в присутствии -Al₂O₃ приводит к образованию пропилена и воды, а в присутствии меднохромового катализатора – к образованию ацетона и водорода. Катализаторы не смещают положения химического равновесия, позволяя быстрее достигать состояния равновесия системы.

Cистему называют открытой, если возможен обмен с окружающей средой, как веществом, так и энергией. Примером является проточный химический реактор. На вход проточного реактора непрерывно подаётся исходная реакционная смесь (ИРС), на выходе выводятся продукты реакции. Химическое превращение идёт в реакционной зоне, где имеется область повышенной температуры и находится катализатор. Если реакция проводится в стационарных условиях, состав реакционной смеси на выходе реактора не зависит от времени. При этом состав смеси внутри реактора, вообще говоря, различен в разных точках. Удобно проводить процесс в режиме идеального вытеснения или в режиме идеального смешения. В первом случае пренебрегают перемешиванием реакционной смеси на макроскопических масштабах, во втором – состав смеси в пределах всего объёма реактора полагают равным составу смеси на выходе. В лабораторной практике проточные реакторы часто используют при изучении гетерогенных каталитических реакций.

Характеристики

Список файлов лабораторной работы