Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 94
Текст из файла (страница 94)
18.64 СЬаргег 18: Рго|егп Гп|егаяюп Тес!|по!о8|сл ° Сотрапп8 |Ье рер|Ые п|ар Пепега|е|1 Ьу рго|ео1у6с сППез6оп оЕ л|5-1аЬе1е6 рго|е|п пптипоргес)р!гасе|1 Ггогп п|е|аЪо1каПу!аЪе!е|1 се1Ь ччпЬ гЬа| |1епче|1 Ггот лл5-!аЬе!ег! |и 6|го сгапз1агюп оГ а |1ейпе|1 сР)4А. 1п |Ье 1апег арргоасЬ, йе л|5-1аЬе1ег! ргосеш ыППез|е|1 лч!ГЬ а ргосеазе, ялсЬ аз Ч8 ргогеазе ог сЬу|по|гуряп, ап|1 |Ье рерл!Пел аге Егасг!опагес! Ьу Я:б-ро!уасгу1агпЫе Пе1 е1ес|горЬогеяя ТЬе лл5-1аЬе1ег) рер|Ые п|ар ь сотраге|1 ччпЬ |Ье тар оЬса!пес! Ггот а л|5-1аЬе!ест рго|е!и |1епче|1 Егот ш чЕгго |гапзспр6оп ап|1 ггапз1аг!оп оЕ а Гспоъчп с!3ЫА.
!Г |Ье рго|е!и шштпоргес|риа|е6 Егот |Ье сеП ех|гась ь Ыепбса! |о |Ье рго|е|п епсос1ес! Ъу йе сРЫА, йеп йе рер|Ые пларз зЬои16 Ъе еззепг!аПу Ыеп6са1 (Х!оп8 е| а1. 1992, 1993; К|Ье1 е| а!. 1995). !.)8!пе СопГго! АпГ!Ьос!!е8 Ечеп |по|ье |попос1опа1 ап6Ьо|Пез ш|егас| погьресгПсаПу чч!|Ь ргосе!пз йа| аге 6!зл!пег Ггот |Ье !ттипо8еп (Е)8иге 18-14, Сотр1ех 3). Апу ри|абче а|ьос|а|е|1 рго|е|п йас ппптпоргес|рПа|ез чпй а соп|го1 аппо|!у аз |чеП аз йе зрес|Пс апг!Ъог)у ь, Ьу ПеПппюп, попзрес|ПсаПу ЪшсПп8 |о йе апл!Ьол!у.
ТЬе гпоге йе сопл|о! ап|!Ьог)у ап|1 |Ье зресГПс апл!Ьос!у та|сЬ, йе 1ея |Ье сЬзпсе оГ еггопеоллз1у сепг!Гу)п8 з попзрес|ПсзПу )пгегзсг!п8 ргогет. Рог з гполлзе топос1опа1 апг!Ьос!у, |Ье ргорег соп|го! ь апо|Ьег пюпос!опа! апл!Ьог)у оГ |Ье зате зиЪс!азя !ог а гаЪЪП зегит, п ыЬе ргеиппшпе зегит Егогп |Ье лате гаЪЬ!|, ап|1 Еог а рипПед гаЬЪ|| ро!ус1опа!, П ь апойег рипПе|1 гаЪЪ|| ро1ус!опа! апг!Ьог)у. !)8!пе Мо!Г!р!е АпГ!Ьог!!е8 ТЬе аЬПпу |о соргес!рпа|е а рго|е!и ЬисЬ аз рго|е)п л' !п Е!Пиге 18-14) ияп8 п|оге |Ьап опе апг!Ьог!у а8а|пз| рго|е|п Х Гпсгеазез |Ье 1ече1 оЕ сопЕЫепсе |Ьас ргоге)пз Х ап|1 л' аге аяте|а|ей |и члчо. А сачеа| Ьеге !з йа| ййегепл ап6ЪосПез гесо8п!ге г)лТГегепл ерпорея зогпе оЕ лчЫсЬ пиПЬГ Ъе оЬ|сигес) !п а раг|ки!аг ргосе|п согпр!ех. ТЬия по| аП ап6ЪосПез зЬои16 Ье ехрессес! |о соргес!р!гаге |Ье зате рапе1 оЕ аыос|а|е6 рго|е|пя !)8!пд СеП !.!пе8 !.ас!с!пе ГЬе ТагееГ РгоЕе!и А соргес!р!гал!п8 ргосе|п зЬои16 по| Ье ргес!р)гасе6 Егот 1узагез оГ а сеП!ше 1асЫп8 йе рго|е!и йа| !з |Ье рптагу саг8ес оЕ |Ье ап6Ьо|1у ГК!Ье! е| а1.
1995). ТЬия сопсго1 !ттипоргес)р)гагез зЬои16 Ъе регЕогтег! Егот сеП Ппез Ггполчп |о 1ас)с |Ье |аг8е| рго|еш. Те86пе В!о!ое!саПу Ве!ечап$ МпГапГ8 А рго|е|п йа| а|ьос!а|ез ъч!|Ь лЬе иппшпоргес!р!|алел! рго|е!и !п а Еипс|юпаПу я8пгПсап| |чау т!8ЬГ ЕаП |о ш|егас| лч!ГЬ Ъ|о1о8!саПу шас6че ти|апЬ оГ |Ье рго|еш апд сопзес)иепС1у тау по| соргес!р||а|е.
ТЬия !Г роза!Ые, оЪ|а|п ог Пепегасе сеП 1шез сопсашш8 Ъ|о!о8!саПу |пасбче ппиапп оГ |Ье |аг8е| рго|е|п. 5исЬ тилапп т)8ЬГ Ье па|игаПу ехрге|ьед ш сег|а!и Ьшпап сеП Ппез Ге.8., !итог-г!ег!чес) сеП| Ппез сопла!п|п8 пш|ап| чегбопз оЕ а рго|еш) ог, а1|егпабче!у, сап Ъе ехргеззед аз ерпоре-са88е|1 ргоге)пк Ъу |гапяеп| ггапкГесл!оп оГ сеПя ТЬе ер1|оре-га88ес1 пппап| ргоге1пз сап йеп Ье зрес|ПсаПу иппплпоргес|рпасе|1 чч!|Ь ап6ЬосПез сПгес|е|1 а8а!пзг |Ье ериоре |а8. Рог ехатр1е, |Ье СиПш Гапи1у гпе|пЬег, Си12, апд ойег рЬуяо!о8!саПу ге1ечап| рЧНЕ-Ь!п6!п8 рго|е!пя зисЬ аз ПЬгопесбп апг! е!оп8!пз В апг! С, ГаПе|1 |о !п|егас| лч!ГЬ а па|игаПу оссигпп8 рош| пппап| оГ рЧНЕ Пепчей Ггот а |ипюг (Е!Пиге 18-15).
Рго(0001 4: реп(г(гсапоп о("Аяосга(ег) Рго(егпа Ьу Со(ттппоргесгр606оп 18.65 ох д и > > кое м- Яогопеодп 190 94 о. Со12 Е1Сс(КЕ 18-15 Сопппшпо гес( 1(аппп о1 ЧНЕ-аддис!а(ег( Рго(е!пд 780-О гепа! сагс1попга се(19 9(аЫу Сгапд(ес(ег( ъч!ГЬ а Ьас(гЬопе ехрге96!оп р(аяпЫ (!ег( !апе>, а р1адтЫ епсог((п8 НА-ер!(оре-са88ег( ъчЫ-(уре рЧНЕ (тгсИе !апе1, апг( а р1адгпЫ епсойп8 НА-ер((оре-Га88ег( Гигпог-г(ег!чег( рЧНС (С162Е) ъчеге 1аЬе(ег( ъч!ГЬ !165)гпе(Ыоп!пе, !убег(, апг( (гпгпипоргес!р!(агег( и ПЬ ап0-НА ап((Ьог(у. Соппгпипоргес(р(гасед ъчеге ъчааЬес( ъчп(Ь нетн4-900 гпм нас(.
Воипг( ргоге!пд ъчеге геди(чег( Ьу е!ес(горЬогед!6 1п а 7.5-1 5% 086соп(пюоиъ 5О5-ро!уасгу1ашйе Ве! апг( г(егес(ег( Ьу 0иого8- гарЬу. 67 ~ рннс 29 о. Е1опд1п а ~ Е1опяп С Теьбщ ЧУЬейег А55ос1а6оп Оссог5 Ве1оге ог Айег СеП Еу5!5 СеП 1уяа гичо1чеа а гпааяче йагир6оп ог" сеПи1аг соиграгггпепгаПгаг(оп, Ьг(п8(п8 (пго ргохгпигу ргоге(па (Ьаг пщЬ( печег погпъаПу Ье (и (Ье дагпе аиЪсеПи1аг 1оса6оп. ТЬ16 ргоньг)еь ап орроггиппу гог попрЬуяо!о8(са) согпр1ехеа го Еоггп айег сеП 1уяа (Р18иге 18-14, Согпр1ех 2).
!и риис(р1е, П 16 роаагЫе Со аирргеаа аисЬ роа(1у616 (п(егас((опа Ьу (пс1ияоп ог ГЬе ге1ечап( рго(е(п ш ГЬе сеП !уяд ЬигТег. Рог ехапър1е, ОЬЬ е( а1. (1998) гис!иг)ес1 ри66ег1, попгайо!аЬе!ег( 6Ъгопес6п гп ГЬе сеП 1уяа Ьи(уег апс1 9Ьоъчес1 (Ьаг и ъчад ипаЫе го ргечепг соргесгрпа6оп ъч((Ь РУНЕ ог (Ье епс1о8епоиа 168-1аЪе1ег( 6Ьгопес6п ргеаепг гп (Ье сеП Ъегоге 1уяа. Ргогп (Ьпа апд о(Ьег сеП!уаасе ги(х(и8 ехрепгиеп(6, (Ьеае аи(Ьога сопс1иг(ег( (Ьаг (Ье 168-1аЬе!ес( 6Ъгопесгш ъчаа аддис(агег( ъч((Ь РУНЕ Ъегоге сеП 1уяа.
Кег!ос!пд Вге Вас!(допой оЕ 1Чоп5ресйс Рго1е!п5 ° 1псгеаае ЕЬе ютс гггепПГЬ оу ГЬе (ттипоргес(р(гауе и ааЬ ЬиЯег. )иаг аа а ЫПЬег сопсепггагюп оу аа!с (и йе 1уяа ЬиКег 16 ПепегаПу гпоге йагир6не ог ргогеиъ-ргоге(п аааос(агюпа, ао а ЫПЬег сопсепггагюп оу да!с ш (Ье ъчааЬ Ьи1уег ъч61, ш Пепега!, гег(исе попдресгбс ргогеиг-ргогеш (пгегас6опа. ТЬе да1( сопсепгга6оп ш йе ъчааЬ Ьи(уег 6Ьои14( Ье г(ггагед (гопъ 120 го 1000 юм !ъ(аС1.
Ноъчечег, ЫПЬ сопсепггагюпд ог да1( сап реггигЪ Я)Я-ро!уасгу1аги(г(е Пе( е!есггорЬогеяа. ТЬегегоге, йе иипшпоргесгрпагеа 6Ьои16 Ье ъчааЬес( ъч((Ь а 6(апс1агс1 аа1( ЪиКег (120 гпм !ъ(аС1) !гииъейаге(у Ьегоге 1оайп8 оп (Ье Пе1. ТЬе пигпЬег ог" ргосейа йаг соргесгрпасе Ьу ч(ггие оу попарес16с шсегасгюп ъчПЬ (Ье апПЬос1у (Р(8иге 18-14, Согпр1ех 3) ог попрЬуяо1о8(са! аааосга6оп ъч(ГЬ ГЬе рго(егп Го ъчЫсЬ ГЬе ап6- Ьог!у 16 га(аед (р(8иге 18-14, Согпр!ех 2) сап Ье гег!исег! Ьу сагеЕи1 ор6пиха6оп ог (Ье сопй- Ьопа гог иппшпоргес(рпа6ои. ТЬгее ргосег(игеа аге сопииои!у адоргей !8.6б СЬаркек 18: Ргоке)п Епкекаск)оп Тес!то!о8!еь ° Рескеазе 1Ье атоиик оЕ ргутагу ап11ЬокГу ки 1Ье кттипоргеслркка6оп. Ресгеаа!п8 1Ье сопсепкгакюп оЕ 1Ье рптагу ап6Ъос1у ш йе птппппоргес!РПа1е лчП! Песгеаае 1Ье соса! пшпЬег оЕ ргоке)пх 1Ьак попьресгПсаПу соргеслрПаке.
ТЬе сопсеп1гакюп оГ йе ап6Ьос1у хЬоп16 Ъе к)есгеахе6 ко а ро!пк лчЬеге 1Ье х!Ппа! оЬка!пе6 Егот апу ьреслТлс ргоке!и !х тахпшгед ге1а6не 1о апу попхреслйс рго1елп. ° Ргес!еат йе сеН Гулаге ьпй гЬе соигго1 ап11Ьойу. ВеГоке регЕогппп8 йе ппппшоргеслрПа1юп лн!1Ь 1Ье хреслТлс ап6Ьос1у сПгескед а8а)пхк 1Ье ргокелп оЕ !пкегеьк, саггу опк ап пппшпоргес!РПа6оп оЕ 1Ье сеП 1ухаке н61Ь ап ехсеха оЕ йе сопкго! ап6Ьок1у ап6 ргокеш А — 5ерЬагохе !Наг!олч ап6 1,апе !988). РлхОТЕ1!Ч 1ОЕМТ1Е1САТ1ОМ 1Г а поче1 соргес!р!1а1ес1 ргокеш лчах опЬПпаПу к)екеске6 Ьу хл!чег ака!п)п8 ог !аЬе1лп8 лч!й !лл5]гпекЬюшпе, 1Ьеп П сап Ье ЫепклТлес$ Ьу оЬкашш8 ргппагу хек)пепсе шЕоппабоп, е!1Ьег Ъу гПгеск Вйпап Пецгас1а6оп !АеЪегао!6 ек а1.
!987; Капю ап6 ТялцПа 1999; Ьоо апк! Миепхкек 1999) ог Ъу така арес1готе1гу (СопгсЬеапе апк! Ра11егаоп 1999; !еплеп е1 а1. 1999; ЪЧП)с!па ек а1. 1999; Уакеь е1 а!. 1999). РапаПу, хес)пепсе !пЕоппакюп !а оЬка!пег) оп 1Ье рер66ех йак геял!1 Екот шкегпа1 рго1ео1у6с с1еача8е оГ 1Ье рго1еш чбй кгуряп. ТЬе пппппшп атоппк оГ рго1еш гек!шкет ко оЪкапл пхеГп! !пЕоппакюп Ьу еПЬек Ес!тап хек!пепе!п8 ог тая аресккотекку ПерепсЬ оп а пшпЪег оЕ Еаскогя шс1псПп8 йе ргорег6еа ап6 сЬагаскек оЕ 1Ье ргокеш сопсегпек! апд 1Ье тейод оГ аагпр1е ргерага6оп. 1п Пепега1, Ебтап хек)пепе!пц гес)п!геь -!О рто1еа оЕ рго1е!и Еог хес!пепе!п8 оГ гпкегпа1 ргокео1убс Гга8тепкл !500 пц оГ а 50-1сР ргокеш).
51аке-оГ-1Ье-агк таах ьрескготекгу текЬокЬ аге токе хепякгне апс1 сап Ье паек! Еог аецпепс!п8 ак ркогпо1е ог яйркопю1е атоппкя Аь а геял11, тая-хрескготекгуЬаьеб арргоасЬех аге )псгеаяп81у 1Ье текЬок! оЕ сЬоке, Макпх-аахлакед !ааег к)еюгр6оп ютгакюп — кипе оЕ ЕППЬ1 !МА).Р!-ТОР) таах зресккотекгу сап Ье плед 1о оЪкаш а реркЫе "гпахх тар," нчплсЬ сопка!пз 1Ье гпаахеа оЕ аП оЕ йе рер66еь к!ек!че6 Егот 6!Вехбоп оЕ йе ргоке!и ЕСопгсЬеапе ап6 Раккекаоп 1999). ТЬ)я таха тар ргочЫеь а пп)с!пе Тлп8екрппк" оЕ1Ьак ргокелп, лчЬЫЬ сап Ье сотрагес! а8а!пьк 1Ье ргесПскед таах тара оЕ аП )сполчп ргоге!па ко аЫ ш !ПепПГу1п8 1Ье ркоке!и.
Опсе йе Ншпап Оепогпе Рго)еск !а соплр!екед, йе ргесПскес1 хекрлепсе апс1 йеге1оге 1Ье ргесПскек1 таха тара оГ аП Ьшпап ргокеть ич11 Ъе ачал1аые 1п ПакаЬаьея А!кегпабче)у, !!с)шс1 сЬготако8карЬу — 1аллбет М5 (ЕС-М5ГМ5) сап Ье пхес1 ко оЬка!и ргппагу аес)пепсе лпЕоппабоп оп рер1Ыеа лч!1ЬПп йе сПВехк Е!епхеп ек а1.
!999; Уакеа ек а1. 1999). ТЬЕа вес)пепсе !пГоппабоп сап а1ао Ъе пае6 ко Ыеп6Гу а ргоке!и. Ак 1еаак пп61 1Ье согпр1екюп оЕ1Ье Ншпап Оепоте Рго)еск, 1Ьеге ъчП! ь6П Ье а р1асе 1ог кгасП6опа! ЕсЬпап ьес!пепе)п8 аа а коо! Гог рго1еш Ыепбйса1юп. А)йопПЬ хес)пепсе Пака сап Ъе оЪка!пе6 пх!пц ркото!е агпоппкх оГ ркоке!и, 1аг8ег цпап66еь оЕргоке!и сопяькеп11у ргонЫе Ьепег апд тоге ппатЬППпопх Пака. ТЬы, а я8тПсапк аса1- !п8-пр Егот йе !пгба1 пппшпоргес!РПакюп !х ПепегаПу гек!и!гей Рог ехатр1е, ко оЬка)п епопцЬ ргокеш (2 )л8) ко Пепегаке ргппагу хек)пепсе шГоппа6оп оГ йе сус1ш РкСсПс4-аххос!а!ест р21слр1, ВеасЬ апс1 со-нчог)сека а1агке6 чч!й 400 15-ст р1акех оГ Ьшпап А!38 сеПх (Х!оп8 е1 а!. 1993). ОЬн!опх1у, 1Ье пшпЬек оГ се!Ь гецшгес1 перепл!х оп 1Ье аЬппк!апсе оЕ 1Ье ргоке)пя сопсегпек! ап6 йе еЕВю!епсу оЕ 1Ье ппгпппоргеслрлка6оп, ппс1егасопп8 йе ппропапсе оГ ор6т1гш81Ье пппплпоркеслрПа6оп ргокосо1 Еог 1Ье раг6сп1аг ргоке!и оЕ 1пкегеьк.
18.68 СЬаргег !8: рго|ет 1пгегасггоп ТесБпо!о8|ег АТЫ!1!опа! Кеаееп18 5|ера |О апс) 11 оу й|ь ргогосоl геди|ге СЬе геа8епгч апс! едигртепг Сог тарргп8, риг|ВсаПоп, апс) аедиепст8 оЕ рер6|!ех Ер)еаае атее 5рессог ес а!. 1998, СЬарсегх 62 апс) 63). СеП8 апг! Т!88ссе8 Арргорпа|е сеП )|песа) 8го|чт8 т си)Сиге МЕТНО0 ~ сМРОКТА)||Т ТЪ|а ргоСосо! |чае иаег) Со )г)епг)су руН):аааос)агег) рго|е)пя Сопй6опа аЬои!г) Ъе ор0гпгеед Еог йе ргосе|п ос )псегеас. 1. |ЧааЬ 30 10-сгп р!асеа оЕйе арргорпасе сеПв Еа соса! оЕ-6 х 1Ог сеПа) ш РЬоьрЬасе-ЪиЕЕегесс ааПпе. 5сгаре еасЬ р1асе оЕ се1Ь |псо 1 ш1 оЕ !се-со!8 ЕВС 1уяа ЪиЕЕег.
2. ТгапаЕег еасЬ пи1РПКег оЕ сеП яларепа!оп |псо а шкгоЕи8е сиЬе, апгс сепспЕи8е |Ье сиЪеа ас гпахиишп ареес! Еог 15 ш!пи!ее ас 4"С !п а писго)и8е. 3. Роо! йе аирегпасапса 1-30 ш!) апг) ас!8 30 р8 оЕ йе арргорпасе апс!Ъог)у. Кос)с сЬе иппшпоргес|р|сасе Еог 1 Ьоиг ас 4"С. 4. А|Ы 0.9 гп! оЕ сЬе ргосе|п А — 5ерЬагоае а!иггу. КосЕ йе иппшпоргес|РКасе Еог апойег 30 пипи|ее ас 4"С. 5. |УааЬ йе ргосе!и А — ЕерЬагоае пихшге !п Ъ)ЕТЪ) сопса!и!п8 900 |пМ Ъ)аС1. Кереас сЬ!а юааЬ Егче пюге Пшея Р!паПу, юааЬ йе пихсиге опсе ш НЕТ)ч).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
