Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 49
Текст из файла (страница 49)
ТЬе 1ече1 оу аисЬ аЬеггапс сгапасПрдоп тпау дгеас|у !пС)асе сЬе еас|шасеа оу йе асс!ч!су ог" йе ргопюсег ипдег сеас. 1п аотпе сааея йе Ьас1сдгоипд сагьес1 Ьу аригють сгапасг!рсюп сап Ъе е!ипшасет1 Ьу р1асшд а сгапасдрсюп сегпипадоп ядпа1 ирягеапл ог йе ргопюсег ог" !плетей |Неагт| ес а1.
1987; АгаЫ ес а1. 1988). То гедисе сЬе роядЫ1Ьу ог" еггог, сЬе сопс1сьюпа оЬсашес1 Ьу апа1уяа оГ ргопюсеь ог епЬапсега |лп1сет1 со САТ (ог апу ойег герогсег ептуше асс!ч!су) гпиас Ье соптлгшед Ьу д!гесс аааау оГ сЬе шлъ)ъ)Ав епсодед Ьу опе ог пюге оГ йе сЫгпедс сопягись. ТЬе ассигасу ъч!сЬ ъчЫсЬ сгапасдрь аге ш|с|асед !топ| сЬппепс депеа аЬои!д а!ао Ье сЬес)сед Ьу шаррлпд сЬе ргесЬе 1осадоп оу сЬе 5' Сегш!пил ол сЬе тплъХА оп Ьь сетпр!асе Ел)ь!А. ТесЬпщиеа со гпеааиге тплът !А 1ече1а апд со тпар сЬе 5' сеппии оК шлъ)ъсАа |пс1иде рптпег ехсепяоп, д!деас!оп оГ ТЛХА- лъ)ъА ЬуЬг)да ъччй пис1еаае 51, апд д!деас!оп оу лъ)ь)А-лъХА ЬуЬгнЬ ъч)сЬ Валахе А. Ргососо1а Гог сЬеае суреа оК ехрег!шепса аге с1есал!ес| ш СЬарсег 7.
!п йе сиггепс ргососо1, ъче оис1лпе йгее д|Кегепс ааааух йас сап Ье иаед со десесс САТ епкугпе асбчпу ехргеяед Тгош рСАТЗ герогсег чессоь сгапаГессед шсо тпапипа1лап се!!а (р!еаае аее Г!дите 17-3): шеааидпд САТ асспдсу ияпд йлп-1ауег сЬгошасодгарЬу (ша!и ргососо1), шеаялПпд САТ асспдсу То1!оъч!пд ехсгасдоп чдй огдашс ао!чепь (Елгас а1сегпас)че ргососо1, р. 17.40), апт1 шеааидпд САТ асспчсу То!1оъч!пд д)СТияоп оу ргодисса шсо асш611асюп йи!д (аесопд а1сегпадче ргососо!, р. 17.41). сппа|с САТ епгугпе ах дч|ту ъЬои|д !ос!оде гпос!ъ-степа!ассад се!!а апд се!!а сгапаСесссЫпд а ргогпосег. А сопсго| йас |ас!съ апу се11 ехсгасс аьоиЫ а|ю Ье |пс|идед со гпеаыге йе Ьас1ъдгоипд сопспЬисед Ьу йе сЬ|п-|ауег сЬгогпалодгашя Ак а рот!С|ее соптго| Сот САТ аг дч|су апд сгапаСесч|оп, и хе ехсгась !гол се| 8 сгапасессед ъисЬ а сопасгисс е9и |рред ъч|сЬ а ягопд ргогпосег 15ч40 еаг| у ' ог |асе гед|оп ргопъогегя сусогпеда|оч|гиа |гпгпед!ало еаг|у гед|оп, ог Роиа аагсогпа ч|гиа |опд сегпл|па| гереас| 1|п1ъед со сЬе САТ депе |е.д., р1еаъе атее Бдите С 7-3!.
Т|паПу, геы|са оЬса|пег| едсЬ сЬе САТ аъаау ъЬои|д Ье , 'сопдппед Ьу д|гест гпеаъигегпепЬ оС КтъА. Ргогос015: Мебвигетелг 07 САТ пи Ехггасй 0!~ Митта)!ап Се114 И!ие ТЬ!и-1иуег Оггбтагоегарйу 17 35 вуп!певс ро!У(А) врпа! апб 1гапвспр1юпа! расее в!е 0Ч40 !аге ро!У(А) герюп суп|аеас ро!У(А) ву!а! апб 1гапвспрвюпа! расее вге суп!Сесе Ро!У(А) в9па! апб 1гапвспр1юпа1 расее вае 9Ч40 епса еу40 !а1е ро!У(А) врпа! 0Ч40 1аге ро!У(А) в!9па| Е!С()КЕ 17-3 рСАТЗ Нес(огв Зитгпаг|лег( Ьеге аге 1Ье Теа1игев о( РСАТЗ чес|огв 1Ьа1 саггу 1Ье сосПпе вег(иепсе (ог САТ (Еис(сочв апс( 50Ьй1г 1987). АП чес(огв !и 1Ье вес|ее соп1а!и (1) ! Ье о!|9|о о( герПса(юп !|епче!| (гот (Пагпеп1оив рЬаее (П огП, (2) ап ог|е|п о( р(авт|с3 герПса(юп |п Е, сой (оп), (3) ап апврк!П!и геяв(апсе гпаг(сег (Апвра) Ьаг ве|ес(юп и рго|сагуо(- к сеПв, апс( (4) а ро|у(А) а!Ы00оп в|епа! апг) а 1гапвспр(юпа| раиве в|(е |оса(е!| 5 ' о1 (Ье САТ еепе (о гес(исе ! Ье Ьас(гцгоипс) о( геас)1ЬгоиеЬ (гапвспр1юп (гогп ирв(геагп вег|иепсев, ТЬе аггоъчв !и (Ье САТ еепе ап!| |п Апвра |о!Пса(е (Ье гПгес1|оп о( (гапвспрПоп.
ТЬе ве!|иепсе о( |01егев( |в |овес(ес) |п(о !Ье пви|1|р|е с)оп(пе в|1е (МСЗ), (А) ТЬе Ьавк чес|ог )ас(св еи|сагуоПс ргопво(ег апд епЬапсег вес(иепсев. ТЬе ехргеваюп о( САТ !и 1Ыв чес1ог 4(ерегк(в ол 1Ье !пвег(юп ап!! Ргорег опеп(аПоп о( а (ипс(|опа! ргогпо(ег ирв(геап1 о((Ье |п(гоп апс( САТ депе. Ри(а(гуе епЬапсег е(етеп(в сап а|во Ье |овес(ес( ирв(геагп о1 1Ье ргопво(ег ог !и 1Ье ВатН1 ог Ва|| в|(ев !|оъчпв1геат Тгопв 1Ье САТ 9Епе.
(В) ТЬе ргопва(ег чеС(ог соп(а|па ап сЧ40 ргопю(ег ирв(геат о( 1Ье |п1гоп апс( (Ье САТ еепе. Е))4А вес(иепсев саггу|пц ри1а1!че епЬапсег е|еп!еп|в сап Ье |пвег1ес( е|1Ьег ирв1геат ог 4(оччпв1геат (гогп !Ье ргото(ег-САТ 1гапвспр(юп оп|1. (О ТЬе епЬапсегчесгог сагпев ап БН40 епЬапсег )оса1ес( г(оччпв1геат ггогп (Ье САТ репе апс( ро|у(А) а!ЫПюп в|епа!.
ТЬе епЬапсег а|с в |и 'креп(|Ту|па (ипс(|оба! ргогпо(ег е|епвеп|в Ьесаиве |19 ргевепсе ойеп геви(19 |и ЫеЬ (ече(в о( 1гапвспр(юп о(1Ье САТ репе. (МосП(|ег(, чч|(Ь реггп|вв|оп, (гот Ргогпеца Согр.) Ргогосо) 5: Меалигетепг оЕ САТ т Ехггасгл ау Матта))ап Се)Ь Еулги5 ТЬ)п-)ауег СЬготагодтрЬу ! 7 37 СеП5 апг1 Т)55оед СиИигес) татта))ап се))а ггапауес1ес) чч)16 рСАТ чесгогх саггутд йе О)чА оЕ глгегея ТЬе се!Ь аЬоп!г1 Ье ггапауесгег) )пяпд опе оу йе ггапауесгюп ргососоЬ )п СЬарлег 16) ъчПЬ а СЛТ героггег сопягпсг )е.д., гЬе РСЛТ3 аепеа) апс) ап елгргеяюп р!аашЫ сопга1шпд йе 11-да1асгоаЫаае депе )РСМЧ-5РОКТ-П-даЬ р!еаае аее Р)доге 16-2 ш СЬаргег 16) ог апойег героглег депе ашгаЫе Еог погпла!Ьгпд гЬе геап1ь оЕ СЛТ аязу.
Рог г)асада оу йе РСЛТ чесгог аепеа, р1еаае аее Р)доге ! 7-3. МЕТНО0 РгерагаПоп оЕ Тгап5Еес)ед СеП РеПеЕ5 !. Бае депс1е аар)гагюп го гепюче 1Ье тейшп Егот ггапаЕессес) гпопо)ауега оЕсеПа цгогч)пд ш 90-ппп Пяие си1)иге ЙЬЬеа. Ч'ааЬ йе топо)ауега йгее гппеа ъч)й 5 т1 оЕ РВ5 лч)йопг са1- стт апс1 тадпеяшп аа1пс 2. 5гапс) 1Ьс спаЬса аг ап апд!с Еог 2 — 3 плшпгса го апочч 1Ьс 1ааг ггасса оЕ РВ5 со с)гаш со опс аЫе. Кегпоче йе 1ааг ггасеа оЕ РВ5 Ьу аарйапоп.
АсЫ ! гп) оЕ РВ5 го еасЬ р)аге, апс) сье а гпЬЬег ро)кегпап со легаре йе сеПа шсо гп!сгоЕпде гиЬеа. 5)оге йе гиЪеа ш ке ип61 аП оЕ 1Ье р)агеа Ьаче Ьееп ргосеяей 3. Кесочег йе сеПа Ьу сепг66лдагюп аг тахшшпл ареес) Еог 10 аесопс)а аг гоопл геплрегагпге ш а ппсго6лде. Сеппу геяьрепс1 1Ье сеП реПеь ш 1 гп1 оЕ ке-со)д РВ5, апс) адаш гесочег йе сеПа Ъу сепгПЕпдагюп.
Р еточе 1Ье )ая ггасеа оЕ РВ5 Егогп йе сеП реПеь апс) Егопл йе лчаПа оЕ йе гиЬея йоге 1Ье сеП реПега аг — 20'С Еог Ьппге апа)уяа ог ргераге сеП ехггась Ьу е)йег оЕ йе тегЬос)а ш 51ер 4. ТЬе РВ5 сап Ье сопчеп)епг1у гегпочес) ЫгЬ а спароааЫе ргрепе Пр аггасЬег) го а часпшп 1ше. 1)ае депг1е апсгюп, апд гопсЬ йе Пр го гЬе сшгуасе о) йе!н)ггЫ.
)Сеер йе Пр аа Еаг алчау Попл йе сеП редел аа роаЫЫе гчЫ!е йе Пшс) Ь ъчйдс)гагчп Егош гЬе плЬе. ТЬе р|репе Пр сап йеп Ье ыег1 го часпппл 1Ье лча!Ь оу 1Ье гцЪе го гешоче апу аг)Ьегепл с)гор!ега оЕ Пшй. РгерагаЕ)оп оЕ СеП ЕхЕгасЬ 4. ).уае йе сеПа еПЬег Ьу гереагес) сус)еа оЕ !геегПпд апс) йалчшд ог Ъу шспЪаппд йе сеПа )п с)егегдепг-сопла)п)пд ЬиЕЕега. ТЬе 1аггег ь а с)шс)сег апс) еаяег тейпе) оЕ сеП!уяа йаг регт)га САТ, )З-да)ассоаЫаде, апс) ойег гпаг1сег депе аааауа со Ъе ас1арсес) го а 96-ччеП ппсгогпег р)аге Еоппаг (Ргогосо! 6) ) В)дпоп ег а). 1993). ).У515 ОГ СЕЕЕ5 ВУ ВЕРЕАТЕ0 РКЕЕХ1ЫС АЬ)0 ТНАгч1ХС а. Кеаиарепс) гЬе сеП реПег Егопл опе 90-плпл сЫл ш 100 )г! оЕ 0.25 М ТПа-С) (РН 7.8).
Чоггех йе аиарепяоп ч)догопа)у го Ъгеа1с ир с)шпра оЕ сеПя Ь. Ьпагпрс)Ье сеПа Ъу йгее сус1еа оЕ 6еег)пд )п а с)гу ке!ейапо) Ьа)Ь апс1 1Ьалч)пд аг 37"С. Ма1се апге йаг йе гпЪеа Ьаче Ьееп таг1сес) чч)1Ь егЬапо1-лпао)пЫе ш1с, с. Сепгг)Еиде йе апарепаюп оЕ спагпргеП сеПа аг гпахппшп ареес) Еог 5 т)пи!ее аг 4'С ш а ппсго6лде. ТгапаЕег 1Ье аирегпагапг го а ЕгеаЬ гпкгоЕиде гиЬе. 5ег аяс1е 50 р) оЕ й|а аирегпа)апг Еог 1Ье САТ аяау, апс) йоге йе геташс)ег оЕ йе ехггас) ал -20'С. 17.38 СЬаргег 17: Апа)уяя оу Сепе Ехргеягап гп Си!гигед Мапгпга!Еап Се!Ь Ь515 ОГ СЕЕЕ5 С)5!Ъ)С ОЕТЕКСЕМТ-СОЬ)ТАПЯ)!МС ВСяТГЕК5 а.
То 1уяе се!15 мдй десегдепг, геяьрепг1 сЬе се!1 ре!1еь Егот 5сер 3 Еп 500 Ес! оЕ )уяя ЬиЕЕег. 1псиЬасе йе пихсиге Еог 15 пиписея ас 37"С. 0яе )00 Сг! оЕ й!я !уяа ЪиГЕег рег ееП реПес Еог ехсгаеь ргерягее! Ггот ееПя Вгоячи !и 55-гит гПяЬея. Ь. Кегпоче йе се1)и1аг деЬгь Ьу сепсг!ЕиП!пП йе сиЬея ас гпахипши яреед Еог 10 пиписея сп а т!сгоЕиае. Кесочег йе юрегпасапс. Аяяау САТ асдчиу ия!пП опе оЕ йе гпесЬодя деяспЬег1 !п й|я ргососо1. 5пар Егеехе йе геша!пдег оЕ сЬе с!еагед 1уяасея !п! !я!и!д тсгодеп апд ягоге йет аг — 70'С.
ОеФесбоп оЕ' САТ АС6ч!Ту ! )5!пд ТЬ!и-!ауег С!тгогпа$одгар!су 5. !псиЬасе а 50-П1 а!!г)иос оЕ йе се!1 ехсгасс Еог 10 спсписея ас Ея5'С со !пассгчасе епдоцепоия деасесу1аяея. 1Е сЬе ехсгаес ь с)оиду ог прас!ие ас сЬ!я я!аде, геточе сЬе рагс!ссс!асе гпасепа) Ьу сепсп6ядасюп ас гпахипшп яреед Еог 2 пиписея ас 4'С ш а т)сгобгце. 6.
Мсх еасЬ оЕсЬе яагир!ея со Ье аяяауед яч!ЕЬ 80 П1 оЕ САТ геасс!оп пихтге 1, апд !псиЬасе йе геасс!опя ас 37'С. ТЬе 1епцсЬ оЕ йе спсиЬадоп дерепдя оп йе сопсепсгадоп оЕ САТ !п йе сеП ехсгасс, ячпссЬ сп сигп дерепдя оп йе ясгепПЕЬ оЕ сЬе ргопсосег апд сЬе се!1 суре ипдег !пчеяодасюп. 1п пюяс саяея, !псиЬас!оп Еог 30 пиписея со 2 Ьоигя Ея ыЕ6с!епс.
ТЬе геаедоия саи Ъе !иеиЪасед Гог !оихег рег!одя оЕ сиие !ир со со Ьоигя) ячЬеи сЬе ехргеяяои оЕ ЕЬе САТ депе ы !ояч !и сЬе сгаиясессед ееПя. Ноячечег, !и сЬы саяе, !с В адч!яаЫе со адд аи ада!- Попа! ! О-и! а!идиос оГ аеесу1-СоА со еаеЬ геаеиои айег 2 Ьоигя оЕ )иеиЪасгои. 7. Адд 1 гп1 оуейу1 асесасе со еасЬ яапср1е, апд пих сЬе ю1ииопя сЬогоиПЬ)у Ьу чогсех!пц Еог йгее реподя оЕ 10 яесопдя. Сепсг!ЕиПе йе пихтгея ас гпахипшп яреед Еог 5 пипшея ас гоот сепсрегасиге !и а ткгобгце.
ТЬе аеесу1асед Еоггия оЕ сЫогагирЬешео! рапасои иио сЬе огхаи!и Еиррег) рЬаяе; ииасесу!а!ее! сЫогагирЬешео! гегиашя !и йе ациеоы рЬаяе, 8. !Зяе а рсрессе со сгапяуег ехасс)у 900 )с! оЕ йе иррег РЬаяе со а 6еяЬ сиЬе, сагебг1!у ачогдшц йе 1оячег РЬаяе апд йе шсегуаее, Т)!ясагд сЬе сиЬе сои!а!п!пд сЬе 1оячег РЬаяе сп йе гаеПоасс!ме ячаяге. 9. Ечарогасе йе есЬу1 асесасе ипдег часиигп Ьу р1ас!пц йе сиЬея !п а госагу ечарогасог (е.ц., 5ачапс 5реедЧас) сог -! Ьоиг.
1О. Адд 25 )с! оЕ есЬу1 асесасе со еасЬ сиЬе апд с1ьяо!че сЬе геасс!оп ргодисся Ьу депс1е чогсех!пд. 11. Арр!у 10 — 15 ЕЕ1 оЕ сЬе Йсьо1чес1 геасс)оп ргодисся со йе ог!П!п оЕ а 25-пип я!ка це! Т1.С р!асе. ТЬе ог!П!п оп сЬе р1асе сап Ье шаг!сед мдй а юй-!еад репе!1. АРР1у 5 П1 ас а 6гпе, апд ечарогасе йе яатр1е со дгупеяя яч!ЕЬ а Ьагг дгуег абег еасЬ арр!кадоп.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
