Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 145
Текст из файла (страница 145)
ТЬе 06!Ах гпиас Ье о( ЫцЬ пто)еси3аг ите)цЫ япсе НоесЬ51 33258 доеа по1 Ь)пд ей(с(епс)у со ютай (гацгпепь о( ОНА МеаюгетепЬ 5ЬоиЫ Ье сагпед ои1 гаркцу Со пт)попые рЬосоЫеасЬ(пц апд 5Ыйа !и Яиогехсепсе ' егпьаюп с$ие со сЬалцеа (п септрегасиге. Е(сЬег а Яхед ъчаче!епцСЬ Яиоготесег (е.ц., Ное(ег птоде) ТКО, 100) ог а асапп)пц Яиогехсепсе срестштпетег (е.ц., Н)тасЫ РегЫп-Е!тпег птос$е) МРЕ-2А) сап Ье иаед. ° ТЬе сопсеп1гадоп о( НоесЬя 33258 (М, = 533.9) !и йе геассюп 5(тоЫд Ье (терс!оит (5 х 10 ~ м 1о 2.5 ' х СО-е м), япсе т)иепсЬ)пц о(йиогеасепсе оссигх итЬеп йе гадо о(дуе со ОНА ь ЫПЬ (51оИте апд 51ееп ,' 1985).
Нои ечег, Ьчо сопсегйга1юпх О1 тсуе аге соте((тех иаод 1о ехСепд 1Ье дупат!с гапце о( сЬе аатау. ° АП 0$4А5 аптс ю1ийопа 5ЬоиЫ Ье йее от' есЬ)с$вгп ЬгоптЫе, и ЫсЬ тсиепсЬеа йе Яиогеасепсе от' НоесЬя 3 3258. Ноиечег, Ьесаию Ноесйя 33258 Ьах 1тй(е ай)п !Су 1ог ргосе(па ог гктхА, птеаял гегпепса сап Ье сагпет3 оит ияпц сеП !упасет ог рис(йед ргерагаСюпх о! ОНА (Сеаагопе е1 а(. 1 979; СаЬагса алт3 Ра(цеп 1980). ° 0 п( $)те ес Ь)с$в гп Ьгопхде, Ноесйя дуев аге сеП-реппеапс. 1. Тигп йе йиоготпетег оп 1 Ьоиг Ье1оге йе атьау ь сагпед оис со а!!отч 1Ье птас!Ппе со тчапп ир апс1 асаЪт1Ые. )ЧТтеп Ьоипд то Ь)ВЬ-гпо1еси)аг-тте(ВЬ( доиЫе-ятапт$ет$01$А, НоесЬст 53258 дуе аЬтотЬе тпах(- тайу ас 565 ппт апд епиь гпахипайу ат 458 пгп. 2. Ргераге ап арргорпасе атпоипс о1 Й1шед НоесЬ51 33258 дуе ю1ийоп Ъу сотпЪтшпц 50 р1 оЕ сопсепсгасед НоесЬ51 33258 с!уе ю1иссоп рег 100 ш! о1 йиогошесгу Ъийег (р!еабе бее Аррепйх 1).
ЕасЬ сиЬе (п 1Ье РХА атьау гет!и(геа 3 гп1 оЕ Й1шес$ НоесЬ51 33258 с1уе ао!ис(оп. Тгапбуег 3 тп! о1 Й!и1ед с!уе ао1ийоп со ап арргорпасе пишЬег о1 с1еап 81ась сиЪея 1пс!иде ях ехсга ыЬеа Еог а Ыап)с апд йе яапдагд сигче. Е2иапсгсассоп оГ)гуис!его АНЙ А8.23 ТЬе сопсепсгагегС НоесЬас 33238 гСуе ао!иПоп Ь ргерагегС гп Н,О ас 0.2 шхйп! апгС сап Ье асогегС ас гоогп Сешрегагые ш а !ос!-гнгаррегС Сеет СиЬе. 3.
Ргераге а агапе!агг! сигче Ъу агЫ!08 100, 200, 300, 400, апс! 500 п8 оГ РХА Ггогп йе геГегепсе атос)с ао1исюп со шйчЫиа1 шЬея М!х апг! геас1 йе аЬаогЬапсе оп сЬе ргетнагшес) Пиогоптесег оГ еасЬ шЬе итппейасе1у аГсег асЫПюп оГ йе РЫА. ТЬе геЕегепсе асосСг ю!исюп оЕ РХА ы ргерагесС ш ТВ со а сопсепггасюп оЕ 100 ихгпт!. Весаиае йе Ьгпйпх оЕ НоесЬас 33238 ггуе со ЕгЬСА Ь спйиепсегС Ьу йе Ьаае согп рог!г!оп, ЕЬе Е324А иаегС со сопасгисс йе агапгСаггС сигче аЬои!д Ье Егогп сЬе аагпе арес!еа аа сЬе сея аагпр1е. 4. АсЫ 01 р1 (!е., 1 Сс! оГ а 1:10 Й! иооп), 10 р!, апс! 10 Сс! оГ сЬе ргерагасюп оГ РЬСА, ънЬоае сопсепсгаНоп ь Ьесп8 с1есепшпес1, со шйчЫиа1 сиЪеа сопсагпш8 Й1исес) г!уе ао1иПоп.
1пипейасе1у геас! сЬе Пиогеасепсе. 5. Сопаспкс а агапе!агд сшче р1опш8 Пиогеасепсе оп йе огйпасе апс1 сне!ПЬс оГ геГегепсе РХА (1п п8) оп сЬе аЬас!ааа. Е86гпасе йе сопсепсгаооп оГ РЬ)А !п йе ип)спотнп аашр1е Ьу !псегро1асюп. сЕ йе геайпх Еог йе цпСгпогчп ЕтЬСА ао1иПоп ЕаПа оиьЫе йас оЕ йе асапдагс! сигче, геагС сЬе Ви- огеасепсе оЕ а !агхег гагар!е ог шаСге ап арргорпаге Й1иПоп оЕ йе сагир!е апгС гереат йе аьау. !х)ОТЕ5 ° В!пг)!08 оГ НоесЬас 33258 ь ас!чегае1у !пйиепсег) Ъу рН ехсгегпея йе ргеаепсе оГ с)есегВепса пеаг ог аЬоче йесг сНПса) гпкеПе сопсепсгасюпя апс! аа!с сопсепсгаоопа аЬоче 3 м. 1Г йеае сопс)!тюпа ог геа8епь аге иаес) со ргераге сЬе РХА апс1 ипргоЬаЫе гехи1са аге оЫашег1 ш йе Пиогошесгу аххау, ргессрпасе ап аПс)иос оГ сЬе РЬЕА ичсЬ ейапо1, Нпае йе реПес оГ пис!ек асЫ ш 70ага есЬапо1, с!!880!не сЬе г)г!егс реПес ш ТЕ, апс! гереас йе аьау. ° !Г йе ргерагасюп оГ сея РЬСА Ь ЬгВЬ1у чьсоия аашр1ш8 тчПЬ агапе)агс1 уеПоън с!ра шау Ье ао шассигасе йас йе Й1ис!опа оГ ип)спотнп РЫА тнП! пос сгас1с тнссЬ йе агапе)агс) сигче.
1п йь саае, сЬе Ъеас хо!иооп ь со ичсЬс!гаън стно аашр1еа (10 — 20 )21) тнссЬ ап аисогпаск р!репог ег)и!ррег! нлсЬ а сис-оГГ уеПогч бр. ЕасЬ аашр1е ь йеп Й1исес) ичсЬ -0.5 ш) оГ ТЕ (рН 8.0) апг! чогсехес) чгВогоийу Сог 1 — 2 ппписеа. РЕТГегепс апгоипь оГ йе Й1шес! аагпр!еа сап йеп Ъе сгапаГеггес) со сЬе шйчЫиа1 сиЬеа сопсаш!08 Й1исес) с!уе ао1ис!оп. ТЬе геяг1ь оЪса!пес1 Гуош йе стно аеса оГ аашр1еа аЬои1д Ье сопа!асепс. ° 'с)ае аспьога ог а г)08 паП с!гррег (е.8., НаЬег) со Вепегасе сис-оГГ уеПои Пря А1сегпассче!у, йе Пра сап Ье сш ччсЬ а аЬагр гагог Ыас!е. 5сегП!хе йе сис-оГГ Про ЪеГоге иае, етйег Ъу ашос1ан!п8 ог Ьу итипегяоп ш 709а а!соЬо! Сог 2 ппписеа ГоПотнес) Ьу с!гу!08 тп агг. РгеасегП!хегс, ригроаешас!е гн!Пе-Ьоге Пра сап Ье ригсЬааес1 Гуош а пшпЬег оГ сопипегс!а1 согпрап!еа Ге.8., В!о-Пас!).
ЯоапГ!Га6оп оГ РооЫе-ВГгапс!ес! Р)ь!А Е)5спе Е1Ь|йогп ВгогпЫе 5ошегипеа СЬеге 18 поС аийк!епС РХА (<250 пцlш!) Со аьау аресСгорЬоСошеСНсаПу, ог СЬе РЬСА шау Ъе ЬеачПу сопсашшасесс ичсЬ осЬег аиЬасапсеа сЬас аЬаогЫЛг !ггайасюп апс1 сЬегеГоге ипрег!е ассигасе апа1уяя А гарЫ тнау со еаошасе сЬе ашоипс оГ РНА ш аисЬ аашр1еа ь со гье йе ЕЛЕ-!пс!исесс Пиогеасепсе епипес1 Ьу ейЫшш ЬгошЫе <! > шо)еси1еа !псегса1асег! шсо сЬе РХА. Весаиае сЬе аптоипс оГ Пиогеасепсе !а ргорогПопа1 со йе соса! шаы оГ РЬЕА, сЬе г!иапПСу оГ РЫА ш СЬе аашр1е сап Ъе еагипатегс Ьу сошрапп8 йе Пиогеасепг у!е!П оГ СЬе аагпр!е ън!сЬ сЬас оГ а аепеа оГ агапе)агс)а.
Аа!пс1е аа 1 — 5 п8 оГ РХА сап Ье с!есессес) Ъу йыпесЬосс. Еог пюге шГогшас!оп оп ейЫшгп ЪгошЫе, р!еаае аее Аррепйх 9 апс1 СЬарсег 5, Ргососо1 2. А8.24 Аррепт)гх 8т Соттоп!у 1)зет! Тесйтг)иез т Мо!еси!аг С!оп!пд вагап 'Иштар Мелос! Е)5!пд Е$Ь1йогп ВгогпЫе ог Я'ВК Со!г! 1. 5тгессЬ а зЬеет оУ 5агап тЧгар очег а РЧ тгапзт!1штппатот ог онег а зЬеет от' Ыас)т рарег.
2. 5рот 1 — 5 )т) оу йе Р)х)А затир!е ои1о тЬе 5агап гЧгар. 3. 5рот ет)па! чо!шпез от" а зепез ог РХА соисептгатюп зтапт!агт!з 10.1, 2.5, 5, 10, апт1 20 )т81ш!) ти ап огт!егет! аггау оп тЬе 5агап нЧгар. ТЬе зтапдагд РЬтА зо!шгопз зЬоп10 сопташ а яп81е зрестез оГ РЬтА арргохппате1у тЬе затпе яге аз тЬе ехрестед яге оу тЬе пп1тпотчп РЬтА.
ТЬе Р14А зтапдатдз аге зтаЫе тот птапу птоптЬз тнЬеп зтогет! ат — 20 С. 4. АтЫ то еасЬ зрот ап ет)па1 чо1шие от" ТЕ (РН 7.6) соитатп)п8 2 р8йп1 етЬ)т!1птп ЬгошЫе ог ап ес!иа1 чо1шие от" а 1:5000 Й1ит)оп от т))тпетЬу1зи1уохЫе <1> (РМ50)т5'т'ВК боЫ <1> атос)т. Мтх Ьу р)ретт)пЕ пр апт! т!отчп чн)тЬ а тпкгортреое.
5. РЬото8тарЬ тЬе зротз ияп8 зЬогт-чтаче!еп81Ь 1ЗЧ 1!1шшпатюи Тот ейтгВши ЬготпЫе, ог 500- пш ттапя11пппиатюп Гог 5т'ВК бо18 (р1еазе зее СЬарсег 5, Ртососо1 2). Езогпате йе соисептгат)оп от' Р)х)А Ьу сошрапп8 1Ье шсепяту от" Впогезсепсе 1и йе заптр!е тлтЬ тЬат от тЬе агапе)агт! зо!шюпз. Аеаго8е Р!аде Ме$Ьос! Соптапипапп тЬат тпау Ье ргезеит ш тЬе РХА затпр1е сап е)йег соптНЬпте со ог т)пепсЬ тЬе Виогезсепсе. То ачоЫ йезе ргоЫешз, йе Р)х)А затир1ез апт) зтапс)агт!з сап Ье зрит!ее! опто тЬе зпгтасе оу а 158 а8агозе з!аЪ Ее! сои!а)п)п8 етЬЫштп ЬгошЫе 10.5 )т8йп1). А)!отч йе Ее! то зтапт1 ас гоош тептрегашге тот а тече Ьопгз зо тЬат япа!1 соитапипатш8 гио1есп!езЬаче а сЬапсе то с!1)Тозе аъчау.
РЬото8тарЬ тЬе Ее! аз т!езст)Ьет! 1и СЬартег 5. М!п1ее! Мейос! Е!естгорЬогеяз тЬгопЕЬ ш)и)8е!з 1р!еазе зее СЬартег 5) рточЫез а гарЫ апт! сопчеп)епт тчау то тиеазпге йе с)паит)ту от" РХА апт! то апа1уге Ьз РЬуяса1 яате ат тЬе затпе шие. ТЬ)з 1з тЬе шетЬос! от' сЬоке 1К тЬеге 1з а розяЪт1Ьу йат йе затпр1ез шау сои!а)п я8п)ттсапт тргаптЬ4ез от' Е)х)А. 1. Миг 2 )т! от" тЬе РХА затир1е чн11Ь 0.4 )т! от' бе1-1оасВп8 Ьпйег!Ч 1ЬгогпорЬеио! Ыие оп1у; р!еазе зее ТаЫе А1-6 тп Аррепт!1х 1) апт! !оат! 1Ье зо1шюп 1пто а з101 1и а 0.8огЬ а8агозе ш1018е! сопташ)п8 ейЫшш ЬгошЫе (05 р8йп1).
5УВК СоЫ Ь гоо ехрепяче то ые гопОпе1у 1п тЬтз тесЬп1ттпе. 2. Мтх 2 р! от" еасЬ от" а зепез от" зтапт1агт1 Р)х)А зо1шюпз (О, 22Ь 5, 10, 20, ЗО, 40, аит1 50 )т8/тп!) ълй 0.4 р1 от бе!-1оат!1иц Ъцттег 1Ч. 1оас! 1Ье заитр!ез што йе чче11з от" тЬе Ее1. ТЬе зтапг1агт! РВА зопптопз зЬоп1г! соптатп а яп81е зрестез оу РЬтА арргохппате1у гае таите яге аз гЬе ехреетее! яге оу тЬе ппЬпотчп РЬтА. ТЬе РЬтА зтапг1агйз аге зтаЫе тот тапу топтЬз тчЬеп зтогед ат — 20 С.
3. Сапу оит е1естгорЬотеяз ипп1 йе ЬгоиюрЬеио1 Ыие Ьаз пщгатет! -1 — 2 стп. 4. Резза)п тЬе Ее1 Ьу ппшегяи8 Ь тот 5 гшиптез тп е1ессгорЬогеяз ЬпКег сопташш8 0.01 ьз МЕС1,. 5. РЬотоагарЬ тЬе Ее1 пяи8 зЬотт-чтаче1еп81Ы)Ч 1ттат!)ат)оп (р1еазе зее СЬартег 5). Сошраге йе титепяту от' Впогезсеисе от йе пп)тпотчп РЫА тч11Ь йат от' тЬе Р)х)А зтапс!агс)з аит! езогпате йе с!иапт)ту от" РЫА тп йе загир1е. Меахигетепг о)'Каг(!оагг!чту т ')х(иг!е!г Ае)г(х А8.25 МЕАЯ) гаЕМЕ)ь)Т ОГ гхАО1ОАСТМТУ 1$Ч )ь)$)СЕЕ!С АС10> СА()Т)О(х(: Р1еаае аее АррепеПх 12 (ог арргорПаге Ьапд)108 01 гпагеПа1а таг)сед сч)сЬ <1>. Кагбоасоче гаосорех < $> аге иае6 аа сгасегх со топЬог сЬе рго8геаа ог' тапу геассюпа ихе6 со зупйеяхе 1)1)А апд КЬ)А.
То са1си1асе йе е6)с(епсу ог' хисЬ геас6опя К !а песеяагу со теахиге ассигасе!у йе ргорогсюп ос йе гаебоас6че ргесигзог )псогрогасег) шсо йе деягег) ргог)исс. ТЬПа Поа1 сап Ье асЬ(ечес1 Ьу ьчо псесЬойе (1) Йсуегепс!а! ргессрйасюп ог" йе пие1ек асЫ рго6- исса ичсЬ спсЫогоасе6с аеЫ <$> (ТСА) апг) (2) 61сгегепс)а! аг)аогрсюп ог" йе ргодисо оп!о роя6че!у сЬаг8е6 хиггасеа (е.8., 0)-8! рарег).
Ргессрйа6оп о1 )ь)ос!ек АссгЬ счсй ТгкЫогоасебс АсЫ 1. ()ае а хой-1еаг) репе!! со 1аЪе! $Ье арргорпасе пшпЬег ог "чггЬастап СЕ)С 8!аха 6Ъег 6!сегх (2А-ст сбатесег). 1тра!е еасЬ ог' йе 61сега оп а р)п асис1с )псо а ро1уяугепе хиррогс. 2. 5рос ап ассшасе1у )споъчп чо1шпе (ир со 5 $$!) ог еасЬ хатр1е ю Ье ахаауе6 оп сЬе сепсег ог' еасЬ ог' сччо 1аЬе1ег1 6!сегя Опе ог" !!ге 61сегх Ь ихе6 со пгеахиге йе соса! апгоипс ог'гайоаебчау гп сЬе геассюп (Ье., аеЫ-ао(- иЪ|е ап6 аеЫ-ргеесрЬаЫе га6$оаес(ч(су). ТЬе осЬег 61сег ь ые6 со гпеахиге оп1у йе аеЫ-ргеегрссаЫе гайоае66су. Набег сЬе еопйсюпх ПеаепЪе6, ОНА ап6 КНА шо!ееи!ех >50 пие!еосЫех $008 счП! Ье ргееграасед оп сЬе хиг(аее о! Йе 61сег. 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
