Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 142
Текст из файла (страница 142)
Ропе! АИом ау и4ю ъчог)сес) аг йе Кос)се(еИег !пебсше )п йе еаг1у 1930я Нь рго!есг ъчас со ргераге асбне сеИ-Ггее ехсгассь о1 54уре 5ггергососсих рпеитоп)ае ГЬас иои16 репи!с Ьас!е па! СгапяЬггпагюп о1 авгуре ог8апьго а ! и и Его. АС СЬаг 6пзе, ггапс(оппаг!оп Ьас( Ьееп асЬ!ечес) оп) у чий зпгасг, Ьеаг-Ы! ИЫ с(опог се! Ьс Айег гпапу Ггисггаг!08 ЕаИигес, АИоъчау героПег) )п 1932 йас Ье соиЫ Иег йе сиЬяапсе геаропяЫе 1ог сгапх(оппаг)оп Ыго яз)ис!оп Ьу Ьеабп8 а Егеехегйаъч ехсгас! о1 ЕЬе 5 ог8апьгпх со 60'С, гепюи п8 рагИси)аге пзаиег Ьу сепсг!6л8аПоп, апс) раз яп8 йе яз(исюп ГЬ гоиИЬ а 6 1сег прас(е ос рогоис рогсе1а!и (АИоъчау 1932). ТЬ!ь )асс гаер и аз !пс!ис)ед го я(епсе йерс!сь м4зо ЬеИенег) ЕЬас ггалх(огпзас!оп мгаь ап аггИасс саиаес) Ьу ап оссаь!опа) 5-Суре ог8апьгп СЬаг сигч!чес) СЬе ехггасгюп ргосег)иге. АИоъчау'с сиссесс ас е!пп)паПп8 йе пеес) 1ог Ьеас-ЫИес) с)опог се)Ь ъчаь а зпа)ог сгер оп йе гоаг) ГЬаг ечепгиаИу!ес( го ЕЬе г) !хсочегу оЕ РМА аъ 1Ье сгапх(огпз)п8 гпасепа) (Ачегу е! а1.
1944). Ноъчечег, пос аИ о1 АИоъчау'а сеИ4гее ргерагасюпь ъчог(ъес), апг), ечеп ъчЬеп сгапа(оггпасюп ъчаь оЬсаз пес), сЬе е16сзегку ъчаа чегу )омг. АИоъчау тисг Ьаче геаИгес) йаг алехе ргоЫепь ъчеге саиьес) Ьу СЬе сИ)исе пази ге о1 йе ехггасс, 1ог Ье Ье8ап со ьеагсЬ 1ог сИПегепс ъчауь Со !усе 1Ье рпеигпососо апг) Еог с66егепг пзегЬосЬ со сопсепсгаге Пзе сгагьГопп)п8 асИи(у (АИоиау 1933).
Мас)уп МсСагсу (1985) г)еьсг!Ьес1 АИоъчау'ь г)зесочегу о1 ейапо( ргес!р!СаИоп аь 1оИоъчя АИоиау СЬеп !пггос)исег) апоСЬег пеи ргосес)иге СЬас Ьесагпе ап !псИсрепсаЫе рагс оГаИ иог1с оп ГЬе сгапх(огпз)п8 хиЬасапсе Егопз ГЬас Игпе Гоги~асс). Не асЫег) риге а)соЬо) !и а чо)игпзе Ине Пгпеь йас о1 йе ехсгасс ъчЫсЬ гехи!Гес) !и ргес!рЬасюп ог гпоас ос гЬе гпасепа! ГЬас Ьаг) Ьееп ге1еаъег) 1гогп йе рпеипзососсз.... ТЬе ргес!р!Гасег) гпагепа! соиЫ Ье гегИссо)нег) зп ха(С со1исюп апг) ьЬоъчп го сопгап йе ас6че ьийпапсе )п ггапс(оггпас!оп секса А!соЬо( ргес!р(сасюп апс) гегю106оп соиЫ Ье гереагег) аг ъЫИ м4СЬоис 1охх о1 асс!ису. АИоъчау ъчаь сегсазп!у пос йе Игеа регязп со ргесзрИасе пис)езс асзсЬ ъч(й ейапо(.
ТЬЬ сесЬп!с)ие Ьаг) а1геаг1у Ьееп исег) аъ а рип6сагюп гаер Ьу ьечега! Иепегасюль о1 ог8апзс сЬепзьсс и4зо иеге ригг608 очег ЕЬе ссгиссиге о1 гЬе Ьаъес зп 0МА. Ночгечег, АИоъчау ъчас ЕЬе Езгхс со исе еИзапо) ргес!р!)ас!оп со ргераге пзагепа) йаг сои)с! сЬап8е йе рЬепогуре о1 гес) рзепс се! Ис С)па1 ргоо1 йаг йе Сгапс(огт!08 Гасгог ъчас ОНА с161 1ау а с)огеп ог пзоге уеагь )пго Изе 66 лге. Вас А1 1ои ау сои Ы Га г) у с!аз гп со Ье йе )пчепсог оЕ а сесЬп!г) ие СЬаг ь пои ьесопг) пап>ге го ис аИ.
Яапдагд ИЬапо! Ргесгр1$абоп о1 О!ЧА !11 М1сгоЕще ТГЕЬе5 з. Есгппаге 1Ье чо1шпе оГ йе ВМА ао1иг!оп. 2. Ас!)исг йе сопсепггас!оп оГ топоча!епс саг!опс езйег Ьу с!!!ис!оп ъчЬЬ ТЕ (рН 8.0) ЕТ йе 0МА со1игюп сои(а!пх а Ь!ИЬ сопсепггасюп оГ ха1ь ог Ъу асЫЬюп оГ опе оГ 1Ье аа11 ао1игюззс йоъчп ш ТаЫе А8-1.
! Г ЕЬе чо1шпе оНЬе Ппа! зо!ибоп Ь 400 и! ог )езя саггу ош ргесзрЬаПоп Ы а япс!е писгосиИе сиЬе. Саг8ег чо!шпеь сап Ье сПчЫед атопс зечега( ткго(исе тЬея ог ГЬе РЫА сап Ье ргес!р!засег( апг( сепсг!Еисег) зп сиЬез ЕЬас чАП 61 !и а тегПит-зреег) сепспГисе ог и!ггасепсп6з8е. 3. М!х гЬе хо!иг!оп ие11. АсЫ ехасс!у 2 чо1шпеь оГ ке-со!6 ейапо1 апс1 а8аш пих 1Ье со!01(оп ъче11. 5(оге гЬе ейапо!к со!ос!оп оп ке го а11оъч йе ргес!рЬасе оГ 0МА го Гопп. СзхиаПу 15-30 т(пизез зх зиЕ6<зепс, Ьиг ъчЬ<п ЕЬ< яхе оЕ гЬе Р)ъ)А !з япаП (<100 пи<1еогЫез) ог ъчЬеп Ь Ь ргезепг !и япаП азпоипь (<О. ! 08! т1), ехсепг! йе репой оЕ згога8е со ас !еазг ! Ьоиг асЫ агЫ МИС1, го а 6па1 сопсепггасюп оЕ0.0! Ьс РНА сап Ье зсогег) !пг(есзп!зе!у !и егЬапо!к зо1иПопз аз 0 С ог аг — 20 С.
4. Кесочег (Ье 0ХА Ьу сепсгзТи8аг)оп ас 0"С. рог тазг ршрозея сепзг!Ьзсас(озз аг тахипшп зреег) Гог 10 т!пизез !и а пз!<го(исе ь шйзс!епг. Ноъчечег, аз гПьсиззег) аЬоче, ъчЬеп 1оъч сопсепггагюпз оГ РЕЕА (<20 пс)т!) ог чесу ьтаП Егастепгз аге Ье!пс ргосеыей гпоге схзепяче <епспЕи8асюп гпау Ъе ге9шгей Сопгепггпглпе 1ъсис!е!г Аг!гсл А8.15 Е1ОСлсСЕ АЗ-2 АарнаПоп о1 5ирегпалапга Но!с! йе ореп ткго!08е сиЬе ас ап ап81е, ъч1сЬ сЬе реПес оп сЬе иррег а1сСе.
СЛье а д1ароааЫе р1реие Пр алгасЬед Со а часиигп Ппе Со чч1СЬ- гСгаъч 11вд Сгот йе СиЬе. 1паегг йе Пр !иаг ЬепеасЬ йе т101асиа оп йе 1оъчег а1сСе оС сЬе ШЬе. Моче СЬе Пр СоъчаггС йе Ьаае ос йе СиЬе аь йе 11иЫ 1а чп1сЬгСгаъчп. Слае а Пепл!е липс!оп со ачоЫ с!ганн!08 сЬе реПес 1псо сЬе р!рессе Пр. Кеер йе еаза ос сЬе Пр аъчау Ьогп йе реПес. р1паПу, часиигп СЬе ъчаПь оС СЬе СиЬе Со геточе апу алСЬегепг г)гора ос йшй рмп а ара 5. СагеСиПу геточе йе аирегпагапг ъч)СЬ ап аигогпаПс писгорсреССог ог ъч!СЬ а сс!ароааЫе рсреие Пр ассасЬес) со а часишп 1те (р1еаае аее Е18иге А8-2).
Та)ге саге пос со гПяигЪ йе ре1- !ес оу пис1ек асссс (ъчЬкЬ гпау Ье 1пч)яЫе). 1)ае йе рсреие Пр со гелпоче апу с)гора оу Полл! йас ал)Ьеге со йе ъчаПь ог сЬе сиЬе. 1с ь Ъея со ране сЬе лпрегпасапс Сгот ча!паЫе РС4А аатр!еа пп01 гесочегу ос йе ргесср1сасегс РлаЛА Ьаь Ъееп чепПей 6. ЕП) сЬе сиЪе Ьа1г ъчау ъч!сЬ 70% ейапо1 апг) гесепсг1108е ас тахстшп ьрееь! бог 2 т!писеа ас 4 С т а т!его)и8е. 7. Кереас асер 5. 8. 5соге йе ореп сиЬе оп йе ЪепсЬ ас гоопл сетрегасиге ипП! йе!ая сгасеь оГ Пилг) Ьаче ечарогалед. !с ачаа опсе согптоп ргаспсе со ллгу реПеь ос ппс1е!с асн$ зп а!уорЫПгег.
ТЬЬ яер ы пос оп1у пппесеяагу, Ьпс а1ро ппалелсгаЫе, а!псе Ь саыеа депаюгапоп ог" япаП 1<400-ппс1еосгПе) уга8тепса оЕ РХА 18чагеп ес а1. 1987) апал 8геаг1у гедпееа сЬе гееочегу ос1аг8ег сга8тепга оу РС4А. 9. Р!аао1че йе РХА реПес (ъчЬкЬ са ойеп тчляЫе) т сЬе деягег! чо1ите оу ЬиСТег (иялаПу ТЕ !рН Ъесъчееп 7.6 апг) 8 О!).
Пспае сЬе ъчаПа оу сЬе сиЪе ъчеП ъчссЬ йе Ъи)гег. !ъ)ОТЕ5 ° Айег сепсг1108ас!оп лп а писго6л8е, пос аП оу йе РЬСА са лсероясегс оп сЬе Ьоиогп ол йе тссго6л8е СиЬе. Ур Со 50% ог йе РХА га япеагес! оп СЬе ъчаП ог йе СиЪе. То гесочег аП ос йе РХА, Ь !а песеааагу со ъчог)г а Ъеагс ол Пшд Ьас)гъчагсс апд Согчгагд онег сЬе арргорНасе а!иас1- гапс оу ъчаП.
ТЬь асер сап еая)у Ье допе Ьу риаЬ!08 йе Ьеаъс ос Пи!с! очег йе аигсасе игссЬ а гссароааЫе рлреие Пр аиасЬес1 со ап аисотапе ппсгорсреиог. ° Опе чо1ите оу гаоргорапо1 с1> тау Ъе иаег! !п р!асе оу 2 чо1шпеа оу ейапо1 со ргеслрПасе Р)ъ)А. РгеслрПаПоп ъчссЬ гаоргорапо) Ьаь йе аъ!напсат сЬас йе чо1шпе оу!и)исг! со Ье сепсг)6л8егс га япаПег.
Ноъчечег, гаоргорапо1 !а!ела чо1асПе сЬап есЬапо! апгс !а йеге!оге гпоге с!!6 Йси1с со гелпоче; гпогеочег, гю1шеа аисЬ аа якгоае ог аогПшп сЫог!ссе аге тоге еая!у соргессрПасег1 ъч!сЬ РЫА ъчЬеп гаоргорапо! 1а плесам. 1п Пепега1, ргеслрссаПоп ъчПЬ ейапо! га ргеуегаЫе, ип1еаа П !а песеяагу со )леер йе но)шпе оу Пшгс со а пнтпшт. ° 1п Пепега1, Р)ъ)А ргес)р)сасегс Сгогп ао1иПоп Ъу ейапо1 сап Ъе гесс)ми!чесс еая1у !и Ьийега оу 1оъч юпк лсгеп8сЬ, ялсЬ аа ТЕ (рН 8.0). ОссаяопаПу, ЙСПлси11!еа аггае ъчЬеп Ьийега сопсаспт8 МПС!л ог >О.! м !ъ!аС! аге асЫеъс гПгесИу со йе Р!ъСА реПес. 1с са йегеСоге ргесегаЫе со с!!лап!не сЬе РХА лп а аплаП чо1шпе оу 1оъч-!оп!е-асгеп8сЬ Ьийег апгс со агЦиас йе сотроя- А8.16 Аррепт))х 8: Соттоп!у Еттет) Тес)тптт)иет т Мо1еси!аг С)опт8 6оп оЕ йе Ьийег 1атег.
1Е тЬе аашр!е боем пот т!1аао1че еая1у ш а япаП чо1шпе, атЫ а )аг8ег чо! ите оЕ ЬиЕЕег ап6 гереат тЬе ргестрпабоп тч)тЬ етЬапо1. ТЬе аесоп6 ртестрпа6оп птау Ье1р е1ипшате атЫЬюпа1 аа!та ог ойег сотпропепо йат тпау Ъе ртечепбп8 т!1аао1и6оп оЕ йе РХА. Ргес!рйа6оп оЕ 1сМА чч1Й ИЬапо! КХА 1а еРПстепт!у ргес!рпате6 чч)тЬ 2.5 — 3.0 чо1ишеь оЕ етЬапо1 Еготп ао1ит)опт сопташ)п8 0.8 хт ЫС!, 5 хт апипошшп асесате, ог 0.3 тчт аосПшп асетате. ТЬе сЬоке ашопц тЬеае та!та )а т1етегпипе6 Ъу тЬе лчау ш тчрасЬ йе КХА тчП! Ье итет) 1атег. Япсе тЬе ротаьяиш аа1т оЕ с)от)есу! ял1Еасе га ехтгетпе!у 1пао1ийе, ачоЫ ротааяигп асетате !Е тЬе ргестрпасет1 КХА га то Ье т)1яо!чет! тп ЬиЕЕегь тЬат сопташ Я>Я Еог ехатпр1е, ЪиЕЕега йат аге пает) Еог сЬтошатоагарЬу оп оПцо(ЙТ)-се1- )и1оье. рог тЬе ааше геааоп, ачоЫ ротааяиш асетате !Е йе КХА ь а1геаду йъао!чест ш а Ъийег сопташш8 5Р5.
АчоЫ ЫС1 тчЬеп йе КХА Ь то Ье иае6 !от сеП-Егее тгапт1атюп ог течете ттапьспрбоп, ЫС1 юпхт шЬтЬтт шп!абоп оЕ рготеш аупйеыь 1п шоат сеП-6ее ауатешт апд ялрргеаа йе ас6гпту оЕ КХА-т!ерепдепт РХА ро!ушегаье. МОТЕ ° 5о!ит)опт пает! Еог ргестрпа6оп оЕ КХА шиат Ъе Егее оЕ КХаае 1р1еаае аее СЬартег 7). Ргес1р!Еа11оп оЕ 1.агре тсМАь чмЕЬ ЫЬшгп СЬ!огЫе 'ччЬегеаа япаП КХАа (тКХАа апт! 55 КХАь) аге ао!иЫе ш ао!и6опь оЕ Ь18Ь юпк атгеп8тЬ, 1аг8е КХАа (е.8., гКХАт ап6 гпКХАа) аге шао1иЫе апт! сап Ъе геплочет1 Ъу сеп166л8аГюп, 1.
Меааиге йе чо1шпе оЕ тЬе аатпр1е апт1 атЫ 0.2 чо!шпе оЕ КХаье-Егее 8 !ч! 1лС1. М!х тЬе ьо1и6оп тчеП апт1 а!иге К оп ке Еог ат 1еаьт 2 Ьоигя 2. Сепспй8е йе ьо!и6оп ас 15,000г !ог 20 ш!питеа ат 0'С. Ргасагб йе ялрегпатапт, апт! т!1аао!че тЬе ргес)рпатет1 Ь!8Ь-пю1еси1аг-чче18Ьт ВХА 1п 0.2 чо!шпе оЕ Н,О. 3. Кереат Яерь ! апт1 2. 4. Кесочег йе Ь18Ь-шо1еси1аг-тче!8Ьт КХА Еготп йе геаиарепт!е6 реПет Ьу ргестрпат!оп чч!тЬ 2 чо!пшел оЕ етЬапо1. СопсепЕга6пд апт! Ое8айпд Мгтс!ек АсЫ8 чч!ЕЬ Мкгосопсептгатогь !3!тгаут1тгат)оп га ап а)тегпат)че то етЬапо1 ргес)рпа6оп Еог тЬе сопсептта6оп апд т)еьа16п8 оЕ пис1ек асЫ ао1шюпя 1т гет)и)теь по рЬаье сЬап8е апт1 ь раг6си1аг1у иаери! Еог т!еа1ш8 чч!тЬ чету 1отч сопсептгат!опт оЕ пис1ек асЫя ТЬе Мктосоп сагтгЫ8е, ьиррПес) Ъу МтПтроге, ь а септт16л8а) и!сга61тгатюп т)ечке йат сап тЕеаа1т апт! сопсептгате пис1е)с асЫ аашр1еа еЕПс)епт1у. ТЬе ртотосо! ргезептет! Ъе1очч апт) тЬе ассошрапу!п8 потев Ьаче Ъееп ат!арлей Егош тЬоте ргочЫет! оп йе МППроге л'ттеЪ Яте (тчтчи.шППроге.сош).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
