Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 99
Текст из файла (страница 99)
Аг йе епс1 оЕ йе !исиЪа(!оп, асЫ 1Ье ЕоПоьчи8 геа8епич (о йе геасКоп пихшге: 0-)4АР (50 шм) 1 и! Е. со!) ОНА !(0аье (1000 — 4000 пп)гг)ш!) 10! 1псиЬаге 1Ье геасгюп Еог 15 пппи1еа аг гоош 1ешрегагиге. 3. Аг (Ье епс1 оЕ 1Ье шсиЬагюп, асЫ 1 )г! оЕ а пихгиге сопгашш8 а11 Еоиг с(МТРа еасЬ аг а соп- сепггаНоп оЕ 1О гпм апс) 2 )г1 (5 ии)15) оЕ ЪасгеПорЬа8е Т4 ОМА ро1ушегаае. 1псиЬа1е 1Ье геасиоп пихгиге Еог 15 пипШеа а1 гоогп 1егпрега1ше.
4. Кепюче а яиа11 а!и!по( (3 )г1) оЕ 1Ье геасгюп. Меааиге (Ье шаха оЕ ьесопс)-аггапс) ОМА ш йе а1!с)ио( аа с)ехсг)Ъес( ш 51ера 7 апс) 8. 5. То 1Ье геша!пс(ег оЕйе геасгюп, асЫ 5 )г! оЕ 05 М ЕОТА (РН 80). Ехггасг 1Ье иих1иге опсе ъчй РЬепоЬсЫогоЕопп апс) опсе ич(Ь сЫогоЕопи. Весочег йе ОМА Ьу ргесгриаКоп нч(1Ь е(Ьапо1 !и йе ргеаепсе оЕ 0.3 )и( аойиш асе1аге (РН 5.2). О!550!не 1Ье ОМА )и 90 )г! оЕ ТЕ (РН 7.6). 6. То 1Ье ОМА, асЫ: !Ох Т4 ро!упис!еогс4е (с)паье Ьиг(ег Т4 ро!уппс!еогс4е РЕпазе (5000 ип(й)ш!) 1О и! ! 01 !псиЪаге (Ье геас(!оп аг гоош 1ешрегагиге Еог ! 5 пипи(ем 7.
(7ае йе япа11 а1и)иог !тош 5(ер 4 1о с(егегш!пе 1Ье (ога1 апгоип( оЕ гас)(оасг!н!(у апс! йе ТСА-ргесгрКаЫе сопи!а !и 1 )г1 оЕ йе аесопс(-аггапс) аупйеяа геасКоп аа с)еасг(Ьес) !и Аррепс(!х 8. 8. Т)ае йе Е01!ончш8 ес)иаг!оп (о са!си1а1е 1Ье нне!8Ь1 оЕ 1Ье СОМА ауп(Ьеягес) ги йе аесопс)- аггапс( геасг!оп, гаЫп8 !пго ассоипг 1Ье апюип1 оЕ с(МТРа а!геас)у шсогрога1ес1 гпго 1Ье Еггкг аггапс( оЕ СОМА; срш !исогрога1ес( )и 1Ье аесопс(-а(гапс) геас((оп х (66 )г8 — х )г8) 1о1а1 ерш = )г8 оЕ зесопс(-аггапс) СОМА ьупйеа!кес) ччЬеге х !а йе нче)8Ь( оЕ 1Ье Кгаг а(гапс) оЕ СОМА (Его ги 5(ер 6 оЕ 5(а8е 1).
ТЬе аиюипг оЕ аес- опс(-а(гапс) СЭМА асуп(Ьеяхес) !а игша11у 70-8096 оЕ йе ъче)8Ь1 оЕ 1Ье Кгаг аггапс). 1О 1пм м8С! 2 м ТпяС! (РН 7.4) 10 шСУпг! (и-пР)4СТР (400 С)!пппо!е) ! м (МН ) 5О4 КХаье Н (!000 ип)гмш!) Е. соБ РХА ро)ушегаве 1 (10,000 пп(ЬИп!) 70 и! 5 и! !О и! 1.5 р! ! р! 4.5 р! 1Е46 СЛартет 11: Ртератасгоп о(сВХА Е!Ьтатсеь апг) Сепе Ет)епсг)гсат!оп 9. Ехсгасс йе геассюп сопсаспт8 рЬоарЬогу1асег( сРХА (Егот 5сер 6) сч!сЬ ап ег)иа! чо1шпе оЕ рЬепоЬсЫогосопп. 10.
5ерагасе сЬе ип!псогрогасег) г(ХТРа Егопс сЬе сРХА Ъу арии-со1шпп сЬгогпасо8гарЬу сЬгои8Ь 5ерЬадех С-50 ес!ш1гЬгасег1 си ТЕ (рН 7.6) соисашш8 !О шм ХаС1 (р!еаье аее АррепсПх 8). 11. Ргес!рйасе йе е!исес1 сР)х(А Ъу асЫ!п8 0.1 чо!шпе оЕ 3 м аойшп асесасе (рН 5.2) апг1 2 чо1- игиеа оЕ есЬаио1. 5соге сЬе яатир1е оп !се Сог ас 1еаас 15 ги!пи!ее. Кесочег сЬе ргес!р!сасег) ЕсХА Ьу сепсг!Ег8асюп ас гиахипшп ареег1 Еог 15 пс!посек ас 4"С !и а писгоЕи8е.
()ае а Ьапг)- Ье!6 пипипошсог со сЬес)г сЬас аП оЕ сЬе гасПоасбчйу Ьаа Ьееп ргес!рссасес). 12. ЧтааЬ сЬе реПей ъчЬЬ 70'Уо ейапо! аиг! сепсг!Еи8е а8а!п. 13. Сепг!у ахр!гасе аП оЕ сЬе Яи!д (сЬес1с со аее сЬас попе оЕ йе гасПоасстчйу !х !и сЬе аар!гасег( ЯиЫ), апг1 аПогч сЬе реПес со й у ш йе асп 14. Р!хао!че йе сРМА сп 80 ф оЕ ТЕ (рН 7 6) 11 Ь !а со Ъе гпесЬу1асег! Ьу ЕсоРЛ гпесЬу1аае (р! еаае аее 5са8е 3 оЕ йта ргососо!). А)сегпаПче!у, сЕ йе сРХА 1а со Ье П8асег) гПгесс1у со №с! ог 5а11 Пп1сега, ог ап аг)арсис о1с8опис1еосЫе (р1еаае аее 5са8е 4 оЕ й|а ргососо!), геяырепгс сЬе сР)х)А сп 29 р1 оЕ ТЕ (рН 7.6). Айег сЬе ргесср!сасегС РС4А Ьаа Ьееп гегС!аао!чег), ргосеей аа аооп аа Ь Ь Ееаа!Л!е со сЬе пехт асахе !п сЬе аупсЬеай оЕ сЬе сРсчА. ргеегрйайоп оЕ сРЛСА гчпЛ ейапо! га жег! пгапу Пгпеа Сп сЬе сопасгпссюп оЕ а сРЛСА 1гЬгагу.
Весаые СЛе агпоппеа оЕ сРС4А аге папа!!у чету ыпас! (апг) ойеп чету ргесюпа!), аресга! саге ы гегСп!гегС со асЬ!ече гпахппшп гесочегу оЕ сРСхА. рог аг)чссе, р!еаае аее АррептПх 8. Ргососо[ 2: 5(ау 2г Бесопд-зггапд Яупгйегв 1 ТКООВЕЕ5НООТ!МС: ОРТ1МШМС 5ЕСОМО-5ТКАМО СОМА 5УМТНЕ515 ТЬе а!аеа о( йе гад[о[аЬе[ед йгас- апд аесопд-асгапд ргодис(а аЬои!д Ье апа[улед Ьу е[ес(горйогеа(з (ЬгоийЬ ап айгайпе 1% аугоае йе[ (р!еаъе атее СЬарсег 5, Ргососо| 8), иа!пй аа таг[гегь епд-!аЬе|ед 6айпъепса о( а Н(пдй! д)йеас о( их|[6-суре Ьассепорйайе ), ОМА (р[еаае атее СЬар1ег 9, Рго1осо! 10). К йе геасйопя Ьаче ъчог[гед ъчей, сЬе роро!айоп о( йгьсасгапд СОМА то[еси1еа айпи[6 гапйе !и чае (гоги 300 Ьааев со ) 5 [ъЬ, иа|(Ь а гпода| а)ле о( — 2 Ык ТЬе а!ае о( йе ргодисса оГ ьесопд-асгапд ауп(Ьеа(а айпи[6 Ье а(тйаг со йас о( сЬе рори|асюп о( йгасясгапд гпо[еси[еь.
ТЬе ргеаепсе о( 1агйе апюипВ о( атай ргодиссь (< 500 пис(еоск3еа) ь а аиге а!Пп йа1 аупсйеа(а о( йе аесопд-асгапд СОМА Ьаъ пос ъчог|гег| ъчей. Тгипса6оп оГ аесопд-ьсгапд СОМА гпо|- еси[еа (а 1Ье геаи(1 о( Пара йа( аге по1 ййег! Ьу ОМА ро)утегаъе апг| пк1га йа( аге по1 Ица(ед Ьу Е, сой ОМА Иуае. П сЬе гпода! д!аспЬийоп о( сЬе ргодиссь о( аесопд-асгапд ьупсЬеаь !ь ейп|йсапйу ь[ъеъчед 1оъчагд пю)еси1еь о(!оъчег пю|есЫаг ъче(ПЬС, |с 'ь Ьеас со аЬапдоп сЬе ргерагайоп апг3 георйгпсае йе сопд(1)опа о( аесопд-ясгапд ьупсйеа!а. |и гпоас сааеа, ей|с!епС аупсйеа|я о( 1опй пю1еси)еа о( ьесопдьсгапд СОМА сап Ье асЫечед Ьу а[Сег!пц йе га1ю о( 1егпр!а(е СОМА со КМаае Н апд ОМА ро!угпегаае |и йе геас6ол. 1Г сЬе а(ае оНЬе й гас-асгапд СОМА 'ь атайег сЬап йас о( сЬе ьесопд-ьсгапд СОМА, (Ьеп а ь(цп!Исапс ргорог6оп оГ сйе весопд-ясгапд гпо[еси)еа гпау Ьаче Ьееп йепегасед Ьу ье!Г-рг(т!пй гайег йап Ьу гер|асепъепс ауп(Ьеа)а.
5е[Г-рпт[пй йепегасеь а доиЫе-аиапдед ог ")опй Ьа|гр(п" СОМА гпо|еси|е сЬа1 сои(а(па а |оор о( СОМА а1 йе 5 ' епд о( (Ье пю!еси1е, ТЬе соча|елйу с1оьед 1оор иъй ргсчепс адд)с!оп о( !(п[ъег-адарсог |и еиЬаесрлел1 а(ерш. 1( йсе а)[гайпе-айагоае Пе! !пд)сасеь йас йе ьесопд-ьсгапд СОМА ь пойсеаЫу!агйег йап (Ье йгас, сапу ои1 (Ье Гойоъипй сгоиЫеайоос!пц ехреппъеп1 со д)аепоае йе ргорогсюп оГ ае[Г-рг)т(пй |л (Ье геассюп: а. ТгеаС Ьчо айгрлоСь о( гад!о!аЬе[ед Ига( а(гапд апс| Ьчо айг[ио(а о( гад)о1аЬе[ед аесопд ь(гапд и гСЬ С тМ ЕОТА (рН 8.0), 300 тм МаОН Гог 30 т(пи(еа а1 60'С.
ТЬ! ь 1геаипепС Ьудго[уаеа йе КМА апд дела(осев йе ОМА !и йе аатр[еа. ЕасЬ а1к|иос аЬои!д сои(а!и а1 [еаас С Оъ српс о( ТСА-ргес)р!(аЫе тасепа1. Ь. Адд 0.1 чо!ите о( 3 гч НС|, О. С м Тпа-С! (рН 7.4) 1о еасЬ айс[ио(. с. Риг((у йе ОМАь Ьу ехсгассюп ил(Ь рйепойсЫого(оггп апс| ясапдагд ргес|рйасюп ъий ейапо|. г|. 0)аао!че йе ОмАа |и с 0 р! о( н,О. А1Ы с р! о( 3 м мас!. 1псиЬа1е сЬе ОмАа Гог 5 пипыеа ас 68'С 1о айоъч "Ьгйгр|па" Со Гогпь, е. Асы 20 р! о( н О апд 3 р! оГ10х пис[еаае 51 ьийег (2 м мас))0,5 м аос1ыгп асе1а1е [рн 4.5[(10 гпм Лп5О '5% 8!усего1).
АгЫ 5 ип!са оГ пис[еаае 51 1о опе о( йе пчо сиЬеа соп(а|п)пц йе йгас а(гапд о( СОМА апд со опе сои(а(п!пй йе аесопд ьсгапд о( СОМА |псиЬасе ай Гоиг сиЬеа Гог 30 т(посев ас 37'С. П. Апа[уле йе ые о( йгьс- апд аесопд-ьсгапд ргодисса Ьу е!ессгорЬогеа(а (ЬгоиПЬ ап а([ъайпе с А айагояе йе| (р1еаае атее СЬарсег 5, Рго(осо| 8), иа(пй епд |аЬе[ед Ггайтеп(а ог а Нкк1|И д!Иенс о( ич|!д1уре Ьассегюрйайе )ъ ОМА аъ гпадъегь (р!еаае аее СЬарсег 9, Рго1осо! С О). ТЬе йгас-асгапд то1еси1еь ейоиЫ Ье сотр|есе|у Ьудго[уаед Ьу пис[еаае 51, апг1 по гпоге йап С 0 — с 5% ос' йе яесопд-асгапд то[еси(еь айпи!д Ье геа|асапс со д!Пеьс!оп исй йе епаугпе.
К сЬе ргорог6оп оГ аей-рппъед гпо|еси|еа !ь ипассерсаЫу ЫИЬ, |с 'ь ойеп Ье(р(и! со ад)иас йе атоипс о( РМаае Н иаед диной (Ье аупсйеа!а о( сЬе ьесопд ьсгапд. |и адд!1)оп, ае!Г-рг!гп!пй пъау Ье аирргеааед Ьу !пс!ид(пй асйпотус!и 0 (50 рвггп!) ог 4 гпм аод(игп ругорЬоарйасе (КЬупег е1 а!. 1 986) |и йггас-асгапд геасс(опт саса[улед Ьу ач|ап геъ его сгапасг!рсаае. Мосе сЬас аод!ит ругорЬоарйасе айои[д пос Ье иаед иа|(Ь типпе сечете сгапаспрсаъе Ьесаиье |с (пЬ~Ысь йе ро(угпег!а(пй ассвгсу о( йе еплуте (Ко(Ь ес а!.
1985). 11А8 СЬартет 11: Ртератаьоп о1 сРИА ЕтЬтаттел аит( Сепе 1т(еит(6сат(оп СТАСЕ 3: МЕйУ!а6ОП ОТ С0МА ТЬе рготЬлсь оЕ 5га8е 2 аге РЬохрЬогу1агес(, Ыипт-епт1ет1 т(оиЫе-а!таис)ет( сРХАх йас аге 6л11- 1еп8тЬ, ог с1охе то 6. АьасЬ(п8 тЬехе шо1еси1еа то а честот гет)и)тех тЬе атЫ(гюп оЕ ат)артогх ог 1ш(тегз то йе тегпнш оЕ йе сРХАя !Е ат(ар!ига аге ивед, оииг 5та8е 3 апт( ргосеес) гбгесг!у то 5та8е 4. Н !ш)сета аге ихед, 5та8е 3 ишя Ье сагпет( оит тч(тЬ 8геат сИ18епсе. МетЬу1агет) Ьахеа ргогесг тптегпа! гехтпстюп ятеа ш йе т)оиЫе-а!таит)ет( сР)х)А а8ашхг с1еача8е Ъу ЕсоК1, а атер гет)и(тел) то Кепегате соЬеяче тепшп1 айег абсбтюп оЕ т)оиЫе-а!таит)ет( ЕсоК! 1ш)сета со тЬе сР)х)А.
ТЬеге аге ттчо тчаух го ргос)исе шетЬу1асет) сР)х)А: ° Рае 5'шетЬу16еохусутояпе тпрЬохрЬате аа а ргесиьог (и р!асе оЕ т(СТР т1ипп8 Етгхг-хггапт) сР)х(А хуптЬеях (Нап апс) Киьег 1988; Нтье апт! Напаеп 1988). 5есопт(-хтгапт( зупйеяз ь сошр1етес( тьш8 тЬе Еош сопчептюпа1 поптпейу1атет1 Ьахея ТЬе геял!гш8!леш(шетЬу!атет) т(оиЫе-а!таит)ес( сР)х)А Ь рагьа!1у тех(агап! то с1еача8е Ъу ЕсоК!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
