Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 98
Текст из файла (страница 98)
Ногчечег, сЬе рора1асгоп оЕ еРЫАз зуийеяхед ас 55 С зч)11 Ье зЬогсег оп ачегаге йап еР)4А зупйеяхед ас 37'С. 4. Ас сЬе еид оЕ сЬе пссиЪа6оп регюд, асЫ 1 Сс! оЕ 0.25 м ЕЕ)ТА со йе яиаП-зса!е геассюп сопсапип8 сЬе гад)о(зосоре. ТгапзГег сЬе яиаП-зса1е геассюи со ке. Неас йе !аг8е-зса1е геассюп со 70"С Еог 10 пшшсез апс! йеи сгапзГег и со ке. ТЬе еРЫА зупйеяхед ш сЬе 1аг8е-зеа!е геае6оп сап Ье озед йгеес1у аз а сетр!асе т РСКз. 1Е сЬе Еггзс-зсгапд еРЫА Ь со Ье мед аз а сетр1асе Еог зупйеяз оЕ сЬе зееопд РЬСА ягапй аыетЫе йе гпасеиа!з апд ргераге а зчасег Ьай ас 16'С зчЫ1е саггуги8 оос 5серз.
5 апд 6. 5. Меазпге Ъой йе соса1 аиюппс оЕ гад!оасс(ч(су аис1 сЬе агиоипс оГ сгкЫогоасеПс ас(д (ТСА)-ргессрПаЫе гагПоае6чПу (и 0.5 р1 оЕ сЬе яиаП-зса1е геассюи, аз с1езсПЬед )и АрреигПх 8. !и адд)сюп, 11 1з ъчогсЬсчЬПе апа!усдп8 (Ье ргос1цсй оГ сЬе яиаП-зса!е геасНоп СЬгоп8Ь аи аПса1сие а8агозе Ве1 пяи8 арргорПаСе Г)ЫА шаг)сегз (р1еазе зее СЬаргег 5, Ргососо1 8). ТЬе Есгзс-зсгапд еРЫА зЬои!д арреаг аз а япеаг чдй ягез гап8)п8 Егот -0.7 Сй со >6 Сй апд а тода! ча!ое оЕ -2 1гЪ.
ТЬе геташг1ег оЕ йе згпа11-зеа!е геас6ои саи Ье зсогед ас — 20'С. 6. Са1сп1асе йе агпоиис оЕ Пгзс-зсгапд сГ)ХА зупсЬеяхед аз ЕоПоччзс а. $(псе 10 Сс1 оЕ а зо!шюп сопсашш8 аП Еопг дХТРз ас а соисепсгаПоп оЕ 5 шм еасЬ счаз пзед (с.е., 10 )с! оЕ 20 пппо1езЛЬег оЕ соса1 д)з)ТР), сЬе!аг8е-зса!е геассюп шпзс сои!а(п 20 пшо1ез()с! д)х)ТР х 10 )с! = 200 пшо!ез оЕ дар Ь. Весапзе йе пю!еси1аг сче(8Ьс оГ еасЬ дЯМР 1псогрогасед (псо 13ХА )з -330 8(шо1е, йе геассюп сз сараЫе оЕ 8епегас)и8 а соса) оЕ 200 ппю1ез х 330 иц)ишо!е = 66 Сс8 оЕ Г))ч(А с. ТЬегеГоге, Ггоги йе гезп!сз оЕ йе яиаП-зса!е геассюп, српс шсогрогасег1 х 66 )с8 = )с8 оГ Пгя зсгаид оЕ сЕ)ХА зуисЬеягед соса( срги 1Е сЬе таесюп Ьаз счог)год ч е!1, йе у1е!д оЕ 6гя-зсгапд еР)4А зЬоо!д Ье 30-40 оЕ сЬе сче)КЬс оЕ сЬе ро1у(А)' КЫА сп йе геаесюп ипхыге.
Ап а1сегпадче ргоеедше со псошсог зупсЬеяз оЕ сЬе 6гзс зсгапс1 оЕ еРХА ь со те а япа!1 агпоипс оЕ !а-ир]дСТР (10 рСс соса1) сп сЬе 1аг8е-зеа1е геассюп гсезеиЬегс аЪоче апс1 а пшеЬ 8геасег апюопс (100 КСг соса1) оЕ гаебо!аЬе1ед дХТР ш сЬе зоЪзег)оепс геассюп со зупсЬеяхе сЬе зесопд зсгапд оЕ сРЫА. ТЬЬ ргоеедоге Ь!ея деягаЫе Ъееаизе Ь ь сЬеп песеыагу со ехрозе йе арха!спе а8агозе Ке! со Х-гау 6!гп Еог 1опц реиогЬ оЕ шие со оЬсасп а зшсаЫе ппа8е оЕ йе 6гзс-зсгапд ргодосся 7. Ргосеес1 аз зоои аз П !з ЕеаяЫе со йе пехс яа8е сп сЬе зуисЬеяз оГ йе сГ)ХА. 11.42 СБарсег 11: Ргерагас(оп оЕ" сЕ))ьгА Е|йгаг(ес апг( Сепе 1Йепгфсас|оп ТКООВЕЕ5НООТ|МС| ОРТ|МШМС НК5Т-5ТКАМО СОМА 5сМТНЕ535 Тъчо ргоЫепь аге сопииоп1у епсоипсегес$ с|опии йгас-асгапг$ СОМА яупсйеаЬ: ТЬе СОМА 'ь а|юп |и 1епесЬ апг$!ог!оъч $п у|е|с$. ТЬеае ргоЫегпа сап геаи11 Сгогп !пас|ос|пасу $п апу о( СЬе сотропепса иаег$ (ог аупсйеаЬ о(сйе йгас ясгапс$ о( СОМА.
Ноиечег, $п гпоас саъея, сйе си!рпс и 1Ье пъРМА сепср|асе. ° СЬес|г сЬе $псееп(у о( сйе гпРМА ргерага1юп Ьу поийегп Ыосйпд их|па ап апс|аегье ргоЬе сотр|епъеп(агу со сйе сгагьспрс о( а согпгпоп Ьоиае|ъеер|пе Репе. И а гас3$о|аЬе!ег$ Ьапг| о(сйе соггесс 5!хе 'ь с|есессес3 апс$ й сЬе Ьапс| 'ь сг|ар апс$ айагр, сйеп с|еегас|ас|оп о( сйе РМА ргерагайоп ь пос Иъе саиае о( сйе ргоЫегп. ТЬеае с|ауя, пюь ргососо!а (ог аупсйеКь о( йгасасгапг$ СОМА г|о пос иае а с1епа1игайоп асор с|еа|епег$ Со гас|осе аесопг|агу ъсгиссиге |п тРМА. А|СЬоиеЬ сЬеге 'ь 1$сс|е ейесс о( с|епасигасюп оп сйе со(а| у|е|с! ог аче гаке |епе(Ь о( СОМА, | псйис|иа| пс РМАь г31йег |и сйе| г апюип1 о( аесопс|агу асгиссиге алс$ ъий сйиа Ье сгапясг|Ьег3 !псе Сий-!епесЬ СОМА ъисЬ часу|па еСйс|епс|ех. Аа а ргесаи1юп, аоте $пнеа(|еасогя Ьеас сйе|г ргерагас|опа о( пъРМА 'ю Н О ог ТЕ (рН 7.6) 1ог 5 пйпи1ез ас 68'С, (ойоънес$ Ьу гарк| соойпд !п $се игаСег (ттесйасе1у Ье(оге иае |и йга(-Кгапс3 аупйсеы.
° й Сйе у|е!д о( СОМА ь!оъч «ЗОА о( 1Ье ъче|РЬ1 о(1Ье гпРМА |и 1Ье геасйоп), 1геас йсе псРМА ргерагайоп ъи|1Ь ргосе| пасе К аъ с|еасг|Ьес3 Ье|оън. ТЬь ргосес|иге сап аогпе($гпеа ге|еаъе 1$еЫ!у Ьоипг1 ргоСе|пя (гогп РМА апс$ гегпоне !пЫЬ|сога о(йгаС-а(гапг$ СОМА ауп(Ьехь. Аа псисЬ аа 100 ий о( ро|у(А) РМА сап Ье Сгеасес| $п а чо|ите о( 300 и! соп(а|и|ой Сйе (ойоъи|пе: 5 ифгп1 ргосе!паче К 100 тм ТпуеС1 (рН 7.5) 50 тм МаС| 10 тм ЕОТА (рН 8,0) 0.1;6 (ъч)н) 505 |псиЬа(е Сйе геассюп (ог 1 — 2 Ьоига ас 37 С.
Регионе 1Ье ргосе| паче К Ьу ехсгассюп ъи|сЬ рЬепо1 сЫого(оггп а1 65'С (р!еаъе аее СЬарсег 7) апс$ сйеп гесочег сйе пис|е|с ас|с3 Ьу ргес|рйасюп ъисЬ е(Ьапо1 |п сйе ргеаепсе о( 0.3 м хог$1игп асесасе. ° 1псгеаъ(пе СЬе 1етрега1иге о( сйе РТ геассюп 1о Ьеичееп 45'С апс$55'С сап хогпес|теа опргоче у!е|о о( йгас-асгапг$ СОМА. Ноъченег, (Ыа |гпргонегпепс 'ь ойеп соир!ег| со а гес|иссюп !п СЬе ачегаее а|хе о( сйе СОМА роро!айоп. ° 11' епоиеЬ ро|у(А] ' РМА ь ана$!аЫе, орйпсеае сЬе агиоипс о( еасЬ о( 1Ье осйег та!ог сопсропепь т сйе геасйоп (рг|гпега апг$ РТ) 1о сопсепсгас|опа сйас гехи!1 га 1Ье Ь|ейеас у|е|иа апс$!опйехс сОМАв. 5е1 ир а аепсь о( хтай-аса|е геассюпя (еасЬ сои(а|и|па 0.5 — 1.0 ий о( ро|у(А)" РМА) аъ с|еаспЬед Ье!оъч иа(пе г$$((егепс агпоипЬ о( гечегае сгапаспр(аъе (10 — 200 ип|Ь!ий о( РМА) апс3 рг|гпегв (10-1 004о!д гпо$аг ехсесь очег сйе агпоипс о( гпРМА).
Гог соинеп|епсе, аъхите сйа1 сйе анегаее а|хе о( |Ье гпРМА ь 2 $ъЬ. Меаъиге СЬе у|е!г$ о( СОМА Ьу ргессрйаСюп ъчйЬ $се-со|с|спсЫогоасейс ас|г$ (р1еаае атее Аррепс||х 8) агк3 с|е(еггп|пе $Ь а|хе Ьу е1есСгорйогеаЫ СЬгоийЬ а|йайпе айагоае йеЬ (р!еаае атее СЬар1ег 5, Ргососо! 8). Еог |агее-аса|е аупсйеаЫ о( СОМА, иае СЬе сопсепсгайоп о( епхугпе (Ьас а|нее йсе дгеасеь у|е18 о(!опе СОМА Ргогосо1 1: 5гаКе 2: Еесопг(-ьггапг( 5упгЬеь!ь 11.43 СТАСЕ 2: Ьесопд-Мгапд ЬУпйеыВ 1Е (Ье епг(ге 5гаде 1 ргосес)пге Ьаь ьчог1сес) ассогйпц го р1ап, (Ье ргос1псгь оЕ гЬаг а(аде ьЬоп10 Ье а рорп1апоп оЕ регЕесг ЬуЬгнЬ Ъепчееп (Ье опа(па! гпКХАь апс1 Е011-1епв(Ь, Вгьг-ьггапс1 сЕ)ХАь. ТЬе аип оЕ 5(аде 2 (ь со соичегг йеье ЬуЬпсЬ ш(о (011-1епц(Ь с1оиЫе-ьггапс1ес1 с()ХАь.
ТЬе ргпиегь Еог ьуп(Ьеяь оЕ ьесопс(-ьггаис) с()ХА аге сгеасед Ьу КХаье Н, ччЫсЬ !пггос(псеь шсКь (псо йе КХА шо(есу оЕ (Ье сЕ)ХА-шКХА ЬуЪпйс Е. сой 1)ХА ро1ушегаье 1 ехгепс)ь йе 3'-Ьус(гоху1 гепи!ш оЕ гЬеье КХА ргппегь, ияпа йе Еггьг-ьггапс( с))ХА аь а гегпр1аге апс( гер1ас(па йе геша!и!пд ьеашепгь оЕ шКХА !и йе сЕ)ХА-шКХА ЬуЬгЫ лчКЬ (Ье пеъч1у ьупгЬеякес( ьесопс1 ьггапд оЕ 1)ХА. Кеяйиа1 п(с)сь 1и йе 1)ХА-Е)ХА ЬуЬгЫ аге йеп гера(гес1 Ьу Е.
сой 13ХА!фаье, апс( (Ье Егауес( гепшш оЕ йе с(оиЫе-ьггаис1ес) сЕ)ХА аге ро!(ьЬес( Ьу а Е)ХА ро!ушегаье ьпсЬ аь Ьас(ег!орЬаце Т4 1)ХА ро1ушегаье ог РЕи. Р!па1!у, Ьас(ег!орЬаце Т4 ро!уппс1ео(Ые Ыпаье гь пьес( со сага1ухе йе рЬоьрЬогу1аг!оп оЕ 5'-Ьуг)гоху! Огоирь оп йе епг(ь оЕ (Ье с()ХАь ш ргерагаВоп Еог 1фагюп оЕ !ш1сегь ог ас(ар(огь (5(аде 4 оЕ (Ь(ь ргососо!).
АЕ(ег согпр!егюп оЕ (Ьеье епгугпаггс ьгерь, (Ье с(опЫе-ьггапдес) сЕ)ХА гь ргесгриа(ес1 лч(гЬ егЬапо! го гешоче Маа', ччЫсЬ ччои1й о(Ьегьч(ье 1пгегЕеге тч1(Ь гЬе гпейу!аиоп геасгюп с1еьспЬес1 (и 5(аде 3 оЕ (Ыь ргогосо1. МАТЕК!А15 СА()Т!ОХ: Р1еаье ьее Аррепйх 12 Еог арргорпа(е Ьапг(1!па о( ша(епа1ь шагЬес! чч!(Ь <!>. Вг)ЕЕегб апг! Бо!обопб Р1еаье ьее Аррепйх 1 Еог сошропеп(ь оЕ ь1осЬ ьо)и(!опь, Ьипегь, апг1 геадепгь.
О!1ше ь(осЬ ьо(ипопь (о йе арргорпа!е сопсеп(гаоопь. СИогогопи <!> ЕОТА (0.5 М, рН 8.0) Ейапо! МаС1, (1 м) (МН,),5О4 (1 М) 01ььо!че ) .3 ц о( ьо1са (ХН ) 5О, гп а биа! чо1юие о( ) О ш! о( Н О. р1)гегьгег11(ае )Ье ьо1шюп апо ьгоге йе ьо!акоп аг гооги гешрегагаге. Елб((сог(пат(с(е ас!етое г!(пис!еог(с(е (50 гим) Ма)се а 30 шм ьгос1с ьа1игюп Ьу с((ььо)ч(па 33.2 юд о( Д-пгсобпапис(е ас(еп(пе йпас1еогйе (!)-)4АТ)) !и ) ш! о( НаО.
5гоге гЬе ьо1абоп (и Яиа!1 а1(оаогь аг -70'С. 0-Л(А)3 Ь а со(ас)ог (ог Е, соб ПХА!!аале, аь чге11 аь гЬе е1есггоп ассергог; Оо пог соп(цье (г а4)Ь а-Л)АО. РЬепо):сЫого(огт (Пг, ч)ч) <!> Кл)аье Н Ьийег (орпопа!) 20 гпМ Тпь-С1 (рН 7.6) 20 гам КС! 0.1 гим Е))ТА (рН 8.0) О.! гим йгЬюгЬгепо! Оье )ЬЬ Ьн((ег оп1у 1( саггу1иц ош йе а!гегиабче го бгер !. 5ойит асегаге (3 м, рН 5.2) 10х Т4 ро!упис!ео((г!е (опаье Ьи((ег ТЕ (рН 7.б) Тг)ь-С! (2 М, рН 7.4) Ргогосо! 1: 5(аее 2: Еесопс(-гггапс( 5упйегЬ 21.45 Мгх 1Ье геа8епга Ьу 8еп(1у ног(ехш8, апс( сепгг(Еи8е (Ье геасКоп иихгиге ЬПейу гп а ппсгоЕице 1о е1ишпаге апу ЬиЪЫея !псиЪаге (Ье геасг!оп 1ог 2-4 Ьоига аг 16"С.
АЕТЕКМАТ!ЧЕ ТО 5ТЕР 1 (О'АЕЕ55Ю АМО СЕКАКО 1988) )псиЬа1е 1Ье ьесопс)-аггапг) аупгЬе8с геас0оп (аЬоне) Еог 2 Ьоиса аг 16сС )и йе аЬюпсе оЕ )сХаге Н. Риг((у 1Ье геаи!1)п8 с)оиЫе-аггапс)ес) СОМА Ьу ехггас6оп гн)1Ь рЬепо):сЫого(опп апс) ргес)р)га6оп и4й е1Ьапо! (п (Ье ргеьепсе о( 0.3 м аог))игп аеега1е (рН 5.2). О)550!НЕ 1Ье ргес(р(гагег( ОНА )п 20 и! о( 20 ГПМ ТПЯС! (РН 7.6), 20 СПМ КС), 0.1 ГПМ ЕОТА (РН 8.0), 0.1 ГПМ С))1Ь(О(ЬГЕ)10!. О)8Е51 ГЬЕ О(4А (ОГ 20 т)пигеа а1 37сС пай КМаае Н (0.5 ипиа). Ргосеес! 1о 51ер 2. 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
