Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 93
Текст из файла (страница 93)
Риг(Ьеппоге, ГЬеу гпау Еопп а Ьагпег Со йе К1епотн Ега5шепг оЕ Е. соБ РХА ро1ушегаве 1 11ОПп5 Р)н)А вег)иепсш5 Ъу йе г(Ыеоху-шег)(агег! СЬа!п-гегпипаг!оп Нгвг-ягапд вуп(Ьев(в )в )п)5агеб илй ап о55о(ЙТ) рг(!пег-)(п(гег (гергевеп(еб (п Ыас(г). АЕ(ег гегпоча! о( йе ш5(ч(А гепгр!а1е, а Ьогпоро!угпег)с (а)! )в асЫеб 1о йе в)п5!е-в(гапбег) сО)МА ргог)ис!. 5есопг)-в(гапг) вупйеяв )в рг)!пег( ив)п5 ап о!)5огпепс вег)иепсе согпр1егпепгагу 1о 1Ье (Ье Ьопюро!угпепс га!), апд 1Ье геуо!Мп5 ргог)ис! (в с!еанед ччп(Ь гевгпс()оп епг(опас!еавев нчЬове гесо5п(1(оп вЬев Ьане Ьееп (псогрогагеб аг йе епг(в о( йе г!оиЫе-вггапг!ег! СВ(МА гпо(еси)ея 1!.20 С)сарсег11: Ргерага6оп о) сРНА Е!Ьгаггег апд Сепе !депгфслггоп ог" сЬе сР!чА Ъу сепшпа1 сгапагегаае.
ТЬе Ыосх!пц 3'-рЬоарЬасе Ь сЬеп гепючед Ьу аПса- Ппе рЬоарЬасаае, апд сЬе ьесопд Р)4А асгапд Ь аупсЬеяхед Ьу сЬе сотЫпед ассюпа ог КЫаае Н, РХА ро1утегаае 1, апд РЬСА Пцаье. Сагей) сопядега6оп аЬои!д Ье ц)чеп со йе гпесЬод иьед со аупсЬеяхе йе зесопд всгапд ог" сРХА, Ъесаиае П сап десегпппе сЬе сЬоке ог" мессог апд гцссасе сЬе шеар иаед со Пп)г сЬе сРХА со йе чессог. МОЕЕСЫАК СЕОМ)ЧС ОГ РОЕ)ВЕЕ-ЬТКАМРЕР сРМА ТЬе с1ошпц ог" доиЫе-ягапдед сРНА !псо а чессог Ь гасП)сасед Ьу йе аддйюп ог" чаг!оиа саця 1шхегя ог адарсог вес)иепсеа со йе епдь ог" сРХАя ЬупФЬе6с ° Т!ге иве ог геьгггсгаоп епеутеь г!гаг с!еаче татта!!аи РхА чегу гаге!у (е.ц., №г1 апд 5а!!). ТЬеге Ь по циагапсее сЬас ечеп а япаП сРЬСА доеа пос сопсаш а гесоцш6оп ясе сог а рагски1аг геяпсбоп епхуте.
Ночмечег, !г" йе яхе ог' йе сРХА с!опе ог' !псегеас Ь сопядегаЫу япаПег сЬап сЬе яхе ог" йе ачегаце ггацтепс ог цепотк РХА оЪсашед Ьу дсцеас!оп едй йе сЬоаеп епхуте, йеге Ь а цоод сЬапсе йас П чдП пос сопса!и а гесоцшбоп аег)иепсе гог сЬас епхуте. рог ехатр1е, сЬе оддс ог Ппсцпц йе С!С-г!сЬ оссапис!еос!де аег)иепсе гесоцпйед Ъу №г! 1п а 5-хЪ с!опе ог" сРХА аге 1еаа сЬап 1 ш 200. рог 5ай, смЬоае ясеа оссиг, оп ачегаце, опсе емегу 100 1сЪ |п тапппаПап РХА, СЬе одда гЬе Со 1 ш 20, аСП! регЬара ап ассерСаЫе г!а)с.
РМА бп!сего апг! Аг!ар$огь цупйе6с Пп1сегь сопсагпгпц опе ог тоге геяпссюп ясеа ргочсде ап е6ес6че тесЬод гог )ошисц доиЫе-асгапдед сРХА со ЪосЬ р1аяпсд апс1 ЬассегюрЬаце ). чессогь апд Ьаче гшрр1апсед осЬег тейосЬ Сог с1ошпц сРХА рори1аг!опа !р1еазе аее йе 1п)оггпагсоп рапе! оп С4ОМОрО!уМГйСС ТАСС.ПЧС). РоиЪ|е-асгапдед сРХА Ь сгеасед см!сЬ ЪассегюрЬаце Т4 РМА ро1угпегаае ог Е. соц РХА ро!утегазе 1, епхутеа сЬас геточе ргосгигПпц а!пц1е-ьсгапдед 3' сеппспс чдсЬ йесг 3'-+5' ехопис1ео!у6с асс!мсс!еа апс1 ПП 1п гесеааед 3'-Ьус)гоху! сегпши' счссЬ йеи. ро!утеплпц ассп66ея ТЬе сотЬспа6оп ог" сЬеае асс!м!6еа цепегасеь Ыипс-епс1ед сРХА гпо1еси1ея ччЬ!сЬ аге йеп спсиЪасед чч!сЬ а мету!агце пю1аг ехсеы ог"!ш)сег гпо!еси1еа ш йе ргезепсе ог" ЬассегюрЬаце Т4 РХА Пцаае, ап епхуте сараЫе ог'сага!)юпц йе Пцабоп ог" Ыипс-епдед РЫА пю!еси!ея ТЬе ргос1исп ог" сЬе геассюп аге сР!ч)А то1еси!еа саггу)пц ро!утегк Пп)гег аег)иепсеа ас йеЬ сегпиш. ТЬеае то1еси1еа аге с1еанед ас а геяпссюп ясе !п йе Пп1сег, рипйег1, апд!гцасед со а чессог йас Ьаа Ьееп с1еамед чч)сЬ а геягк6оп епхуте йас цепегасез соЬепче сепп!и! согпра6Ые чм!сЬ сЬоае ог" йе Пп1гег.
РоиЫе-асгапдед сРХА то!еси1еа сопсашшц сЬе аупсЬес!с соЬеяче сегпппс кдП ог" соигае !сцасе со еасЬ осЬег, аа ччеП аа со йе чессог РХА. 1с Ь сЬегегоге ипрогсапс со аггапце сЬе 1гцабоп сопсцсюпа со т!и!т!ге сЬе гогтас!оп ог" сЬипепс пю!еси1ея япсе П Ь ехсгегпе1у 1аЬопоиь аиЬ- аес)иепс)у со сеас счЬесЬег сР)4А с!опеа сЬас сопса!и сЬе рагски1аг геасг!сс!оп ясе ас ап спсегпа1 1осасюп Ьаче Ъееп гогтед Ъу епд-со-епд Пца6оп ог" ссчо ипге!асед сР!чАя ТЬе Пцас!оп пихсиге аЬои1д сЬеге)оге а!ъчауь сопса)п а ЬсцЬ спо1аг ехсеаа ог мессог РЬСА со сРХА.
Ночмечег, сЬеае сопсцбопа ягопц1у гачог гегогтасюп ог сЬе чессог Ьу ае1г-Пцас!оп, 1еасцпц со ипассерсаЫу ЬсцЬ Ъас1сцгоипсЬ ог" попгесотЪ|папс с!опек ТЬЬ ргоЫет тау Ье пипипйед Ъу сгеабпц йе с1еачед чессог сч!сЬ а рЬоарЬасаае Ъегоге Пцасюп со сРЫА. !г' сЬе с1оиЫе-ягапдес! сРХА сопса!па опе ог тоге гесоцшбоп ясен !ог йе геаспс6оп епгуте, П чмП1 Ье Ыеамед апд аиЬаес)иепс!у с!опед аа пчо ог пюге РЫА ггацтепся ргечеп6пц сЬе Ьо1а6оп апд апа!уа!а ог СиП-1епцсЬ сРЫАя Ассегпрь со аПем!асе сЬЬ ргоЫет Ьаче 1пс1ис1ед йе Соцосч!пц: !птгодис6оп 11.21 Ву сопсгая, йе ачега8е сПяапсе Ьепчееп ЕсоК1 ысек Ь -4 )сЬ, апд ко сЬеге ь а геакопаЫу Воод ргоЬаЬПЬу йас а сРЬ(А оЕ ачега8е яке М11 Ье с!еачед (псо стчо ог июге ртесек. 1Е и ь еккепба1 со с!опе (псо а гекспссюп ясе сЬас оссигк ак Егег)иепс!у ак ЕсоРЛ, и Ь адч(каЫе со са1се опе оЕ сЬе адд(тюпа! Ргесаисюпк оисПпес1 Ье!оъч со ачоЫ росепиа1 ргоЫеиь. ° Т)те ттгодисйоп о1 тексту! Вгоарк йат мчИ отодт)у апд ртотест патагаПу осситгтд тек*(с6ои к(гек 1а сРХАк.
ТЫк тод(6са6оп сап Ъе г1опе еиЬег Ьу тпейу!асюп оЕ доиЫе-ксгапдед сР14А тч(сЬ а тпесЬу1аке (е.8., М ЕсоК1 птейу1аке) ЪеЕоге атЫЬюп оЕ купйе6с Пп1сегк, ог Ьу шсогрога6п8 5-тпесЬу1 дСТР дипп8 купсЬеяк оЕсЬе 6гя сРХА ягапд (Нап апд Копет !988; Нтье апд Напкеп 1988).
1Е сЬе сРХА ь тпесЬу1асед, йеп а кстати оЕ Е. соП иткс Ье икег1 йас Ь де6с(епс ш сЬе тсг гекспссюп куксетп, тчЬ(сЬ с1еачек РХА ас тейу1сусояпе гекЫиек (Ка1етВЬ ес а1. 1988; ЪЧоодсос)с ес а1. 1989). ЪЬеп сопксгисс)п8 сРЬ)А!тЬгапек Егот ктпаП апюипск оЕ КХА, тапу тпчек68асогк ыпср1у оиис сЬе гпесЬу!а6оп ксер ш ап ейогс со ксгеаит!ше йе ргосес1иге апт1 со Вепегасе йе тпахипшп пшпЪег оЕ сРХА с1опек (е.8., р1еаке кее МсРоппеП ес а!. 1987; Роп ес а1. 1993). ° Т)те ике о1 купйейс адартотк гайег тЕтап 11п)сегк.
Адарсогк аге кЬогс, доиЫе-ыгапдед оПВопис1еосЫек йас саггу опе Ыипс епд (тчЬтсЬ сап Ье 68асед со йе доиЫе-ксгапдед сРХА) апд опе соЬеяче сегишшк (тчЫсЬ сап Ье 68асед со а сотра6Ые сепшпик (и йе чессог). Аг1арсогк аге еьепбаПу ргесш!ш)гегк сЬас до пос тес!шге Й8екбоп тч)сЬ гекспссюп епхутек айег йеу Ьаче Ьееп 68асед со доиЫе-ксгапдед сРХА.
Ноъчечег, сР)к(А ию!еси1ек саггуш8 РЬокрЬогу1асед адарсогк сап Еопп соча1епс!у с1окед с(гси1аг ию!еси!ек (тчЫсЬ саппос Ье с!опед) ог сЬттпепс !шеаг ию!еси1ек (ъчЬЫЬ аге ЫВЫу ипдеягаЫе) дипп8 сЬе киЬкет)иепс 68- а6оп геас6оп 1и сЬе ргекепсе оЕ дерЬокрЬогу1асес1 чешог РХА. То ачоЫ йь ргоЫети, оп1у сЬе кЬогсег ксгапд оЕ йе адарсог Ь РЬокрЬогу!асед ЬеЕоге 68ас(оп со сР!к(А. ТЬе ргодись оЕ йе 68абоп (сР)4А псо!еси!ек саггу(п8 а яп8!е аг1арсог ас еасЬ епд апд дипег адарсог тио1еси1ек) аге керагасед Ъу со!игпи сЬготасо8гарЬу. ТЬе сепшш оЕ йе сР!к)А то1еси!ек саггуш8 адарсогк аге РЬокрЬогу!асед ъч)сЬ ЬассепорЬа8е Т4 ро1упис!еосЫе Ыпаке апд сЬеп 68асед со а 1аг8е пю1аг ехсекк оЕ сЬе арргорпасе дерЬокрЬогу)асед чессог.
!п агЫсбоп со ет)и(ррш8 йе сегпип( оЕ сРЬ(А Еог с!опш8, Пп)гегк сап а!ко Ъе тьес1 ак Ь(пс1- тп8 ясек Сот рптпегк (и РСКк. Ву шс1игПп8 а РСК ксер, 1аг8е сРХА ПЪгапек сап Ье ексаЫьЬед Егот чету япаП атпоипь оЕ сРХА (Еог тесЬодк апд гетчеъчк, р1еаке кее Тат ес а1. 1989; Ни ес а1. !992; Вгаду апд )ксоче 1993; ЕатЬегс апд ЪЙ16аткоп !993, 1997; Койяе(п ес а1. 1993; МсСагтеу апд ЪИ16атк 1994; Кече! ес а1. 1995).
Чес(ог8 08ет! Еог С!оп!щ оЕ СОМА С!А! 1983, а1тоы аП сРЬ)А с!ошп8 кчак сагпед оис ияи8 р1актЫ чессогк, апд сРЬСА !тЬтапек счете икиаПу ташсашед ак а соПес6оп оЕ >1Ок тпдерепдепс1у !тапа(огтед Ьассепа! со1оптек. ТЬеке со1ошек счете котейпек роо!ед, атпр!т6ед ти Пг)иЫ си!сиге, апд ксогед ас — 70'С; июте Ьег)иепс1у, йеу счете гиатпсашес1 оп йе яшЕасек оЕ шсгосеПи!оке 61сегк (р1еаке кее СЬарсег 1, Ргососо! 31).
1п еПЬег саке, йе геки1ск счете иикасьЕассогу. ТЬе ПЪгапек счете с66юи!с со ргекегче тч)сЬоис 1окк оЕ лаЪт16у, апд ксгееп(и8 Ьу ЬуЪпд(хасюп ъчПЬ иш16р!е тасПоасссче ргоЪек ойеп гет)и(гед ра(пксаЫп8 гер1ка6оп оЕ со1ошек Егопс опе пКгосеПи1оке 6!сег со апосЬег. ТЫк ь а 1аЬогюик ргосекк сЬас сап Ье гереасед оп!у а Еетч йиек ЬеЕоге йе со1ошек оп сЬе таксег 61сег Ъесопсе ыпеагед Ьеуопд гесо8пЬюп. гтг(сЬ йе адчепс оЕ тоге ербс)епс счаук со купсЬеяхе сРЕ4А (СиЫег апд Нойтпап 1983) апд ъчсЬ сЬе 8гоъч(п8 ачат!аЬт!Ьу оЕ!ш1сегк, адарсогк, тейу1акек, апд рас)са8(п8 пихсигек, П Ъесатпе рокыЫе со ике ЬассепорЬа8е )~ ак а чессог апд со са1се адчапса8е оЕ йе ЬтВЬ ербстепсу апд гергодистЬт!иу оЕ ш чиго рас)са8(п8 оЕ ЪассепорЬаВе Х РХА (псо 11.22 С)лглргег 11: Ргерага6гш оЕсРлчА Е!(лгагЕел апг( Сеие 1л(епгулсаглоп (п(есгюиа ч)гиа раг6с1ея ТЬе геаи16пд 11Ъгаг(еа аге о(геп!агде епоидЬ го Ье асгеепе6 сдгесг1у лч)гЬоиг агпр116сагюп.
А1гегпабче1у, йеу сап Ье агпрВВел1, агогег) !пл)еЕлп!ге!у ч6йош 1оаа оЕ ч(а- Ь~!1гу, апд, л)ерепг(!пд оп йе раг6си!аг чесгог, асгеепел3 чч(гЬ еЬЬег пис1ек асЫ ргоЪея ап6Ьод(еь, ог ойег!(дапг(я ТЬе Ееагигеь оЕ ЕЬе пюя роро!аг ЪасгегюрЬаде Х чесгога апл( р1аяпЫ чессога наел! го сопаггисг сРЬ(А 11Ъгапез аге оиг1(пел! Ье1очч. Чге гесоттепг) ) УАР апл3 Ва 6ег(чаг(чек (дггагадепе) ог ) У(ражих (ЫЕе ТесЬпо!од(еь) Еог агапл)агл( сРМА 11Ьгагу сопаггисг(оп. ТЬезе чесгога Ьаче Ъееп епд(пееге6 го а1!очч гесочегу оЕ сР!ч(А шаг!а аа р1аатнЬ, апл( гЬеу гЬиа оЪч!аге гЬе пеев Еог сег((оиа ргерагагюп оЕ ЬасгепорЬаде ).
РХА апг( сопчепгюпа! аиЬс1оп(пд (пго р1аат(сЬ. ° ХУАР (ВЬогг ег а1. 1988) сагпеь а ро1ус!отпд в(ге етЬесЫед (п йе гед!оп оЕ йе 1асУ депе сосВпд Еог йе а-сотр!етепгаг!оп Егадтепг оЕ (3-да!асгоябаае, сРМАа ир со 1О (гЬ (п!епдй гпау Ье шьеггес1 шго гЬе ро!ус1опшд яге л(олчпаггеагп Егот йе 1асУ рготогег апг) ехргеааел3 еЬЬег лп шЕессес( Ьасгепа ог (п (пг)исег)!уаодепя еааепба!1у аа беаспЬед Еог ) дг1!. 1п алЫ1- гюп, ИВУАР Еияоп ргосе!пь тау Ъе ехргеаае6 Егогп Ь(дЬ-сору-пшпЬег р!аяпЫа Ео!!очч!пд ехс)а!оп оЕ гЬе Р!ч(А 1паегг апс1 ВапЫпд р!аяпЫ вел)иепсеь Егот гЬе ЬасгепорЬаде ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
