Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 91
Текст из файла (страница 91)
ТЬе пшппе епхутпе сопа|ата оЕа яп81е ро1урертЫе аиЬип|т йат сагНеа ош Ъой К|ъ)Л- апд Р)ъ)А-дерепдепс ауптЬеяа оЕ Р)ъ(А Ьит Ьаа а гедисес1 сараеву то с1е8гас1е КХА ш РХА-К!ъ(А ЬуЪгЫя Миппе гечегае тгапаспртаае а1ао 1ас)са а соптапипатш8 епдопис1еаве аст|ч|ту (Сегагс1 1983; Котеъч|ст ет а1. 1988). ТЬе ачтап епхуше ача!1аЫе Егопт шапу шапиЕастигега |а адет!пате Еог гоит|пе сопатгист|оп оЕ сР!ъ(А 1тЬгапея Ноъчечег, йе Ь|8Ь |ече1 оЕ К)ъ(аае Н асттчпу оЕ тЬе ачтап епхугпе тепда ЪотЬ то аирргеаа тЬе утеЫ оЕ сР)ь(А апс1 то геатгкт ть 1еп81Ь.
Ат тЬе Ье8|пп!п8 оЕ тЬе геаст|оп, йе ЬуЬг|да Еотшед Ьетъчееп тЬе сетпр!асе шК!ъ)А апд тЬе рптпег аге а аиЪатгасе Еог Крахе Н. ТЬия ат тЬе Ье8|пп|п8 оЕ сРХА ауптЬеыя йеге |а а сошрет)!|оп Ьетъчееп де8гас1атюп оЕ тЬе шК)ь(Л апд !шт|атюп оЕ Р)ъ)А ауптЬеяа (Еог геч!еъч, р1еаве аее СЬаптроих 1993).
1п адд|т|оп, тЬе К)ъ)аае Н аст|чКу сап с1еаче тЬе К)ъ(А тетпр1ате пеаг тЬе 3'-Ьудгоху1 теппшть оЕ тЬе 8гоъч|п8 РХА атгапд |Е тЬе ро1утпегаае рагьеа с1ипп8 ауптЬеяь (Котеъчкх ет а1. 1988). ТЬия тЬе пшппе епгуше, ъч|тЬ !та ъчеа1сег соптр1етпепт оЕ епс1о8епоъь де8гадат(че аст|ч|т|ея ь а ааЕег сЬоке ъчЬеп аттешрт|п8 то оЬта!и Еи11-1еп8й сР)ь)А сор|еа оЕ шК!ъ(Ла 1аг8ег тЬап 2 — 3 1сЬ тп!еп8й. ТЬе пшппе апд ач|ап епхугпез д|зр1ау д|ЕЕегепт аа1т апд тешрегатиге орт|гпа Еог тЬе ауптЬеяз оЕ сР)ь)А Егогп КХА теш- 11.12 СЬартет 11: Ртератайоп о)' сРМА й!Ьтапез апд бепе 1дептт)тсаттоп р1агез, апт! й !з сЬетеГоге тгпроггапс со пюд!Гу сЬе спид!г!опз Гог 6гзс-зсгапд зупсЬеяз ассогдтп8!у.
Еечегзе ггапзспрсазез 1асРдп8 ЕМазе Н асйчтсу (е.8., 5ирег5спрс Ггош Ейе ТесЬпо!о8!ез) аге 8епейсайу еп8!пеегед чегяопз оГ сЬе пшппе епхутпе йас сагту ипиайопз гЬас дгазйсайу гейке Кразе Н асйчйу гййоис апу сйииписюп !и РХА ро!утпегазе асг!ч!гу (бегагд ес а1. 1992; бегагд апд Р'А!езз!о 1993). ТЬе Сота! усе1д оГ 6гзг-зСгапт1 сРХА !з зиЬзгапйайу ЬтВЬег чч!СЬ йезе епхушез сЬап гдй попеп8!пеегед гечегзе ггапзсг!рсазез, апд гЬе ргорогйоп оГ Гий-1епйсЬ сРХАз !з яйшйсапг1у Вгеасег (Косегч!сх ег а!. 1988; бегагд ес а1.
!989, !992; бегагд апд Р'А1езяо 1993; Те1езпйз1ту апт1 бой' 1993). !и адд!с!оп, Ъесаизе сЬе ро!утпепгдп8 асйчпу оГ сЬе епхугпе !з пот !пЫЬйед Ьу Ь(ВЬ сегпрегасигез, зупсЬез!з оГ 6гзс-зсгапд сРМА сап Ье сагпед оис аС Сешрегагигез аз ЫВЬ аз 50 С. ТЬгз !з ап адчапСайе ччЬеп СЬе Сегпр1аге ПХА !з 68ЬС1у сгипред шсо зесопдагу зсгиссигез. Еог Гигйег ш(оппайоп оп гЬезе епхутпез, р1еазе зее йе тпГоппасюп рапе1 оп !Чго-!ЧггЧ !СЕЧБС5Е ТВАМ5СйсгТА5Е РгГтегв Гог Ьуп1)гезГз оГ гГгз1-ь1гапг) сО)ч)А Е!зсед Ъе1очч аге Гоиг сурез оГ ргииегз изед со зупсЬеяхе 6гзс-зсгапд сРМА. ° О)т8о(дТ) 12 — 18 пис1еог(дез т 1епуй йат Ь)пдз то йе ро1у(А) тгаст ат тЬе 3 ' тегттиз о1 еи)сагуог)с сейи)аг тИМА тпо1еси)ез.
ТЬе ргипег !з аддет1 со йе геассюп пихсиге ш 1агйе пю1аг ехсеы зо йаг еасЬ ию!еси!е оГ тпИХА ЪтпсЬ зечета1 шо!еси1ез оГ о68о(дТ)„и,з. 5ет)иепс!п8 оГ с1опет1 сРМАз зЬотчз гЬаг рппип8 оГ 6гзс-зсгапд зупсЬезсз ргоЬаЫу Ьей!пз Ггогп гЬе гпозг ргохипа1 оГ сЬезе Ъоипд ргипегз апд !з чету ейк!епг.
° Рг!тег-адаргогз йаг соптатп а Ьоторо1утег)с о118о(дТ) тгаст аг йе 3' гегт)пиз апд а гезтпсйоп я те от йе 5 ' тегттиз (Со!ес!ои8Ь апд Ег!тсх 1985; Кгачч!п)се! апд ЕоеЬе! е!и 1986; Нап ес а1. 1987). ТЬе о68о(дТ) зет)иепсез аге изет1 го ргппе зупсЬеяз оГ сЬе 6гзс зстапт1, ччЬтсЬ сап йеп Ье гас1ед гч!гЬ дС геядиез. ТЫз ргоседиге айоччз сЬе 0ХА со Ье 68асед со а чессог ЬеГоге зупйеяз оГ йе зесопд Ыгапд (Со1ес1оиВЬ апд Ег1йх 1985), ог й епаЫез а зесопт1 ргппег-ас1арсог со Ъе изед со рпше йе зупйеяз оГ зесопт1-зсгапс1 сРМА (р1еазе зее Б8иге 11-2). ° Рптегз 11п)сед го а р!азт1й Рпиппй оГ Гтгзг-зсгапд зупсЬез!з !з сагг!ед оис Ъу а стасс оГ ой8о(дТ) СЬаг !з соча1епг1у аСгасЬес! Со а р!аыпЫ (01сауатпа апт! Вег8 1982, 1983; О1сауапга еС а1. 1987).
Весаизе й ь ойеп поС розяЫе го шсогрогаге епоиВЬ о!тйогпепсайу Сас!ес( р!аыпсд !и йе геассюп пихсиге со асЬсече а Ь!ВЬ гайо оГ ргипег со сетпр1аге, рппйп8 гз изиайу сЬе гаге-1иииш8 зсер т)ипп8 йтз Рдпт1 оГ геассюп. ТЬсз 1иийайоп тези!гз ш!езз ерйстепг игй!хасюп оГ пЖМА сетпр1асез с1ипп8 зупсЬезсз оГ сЬе йгзс зсгапс1 оГ сРХА. Ноъчечег, сЬе гедисйоп ти уте1д оГ йе йгы зсгапд оГ сРХА !з ойзес, ас !еазс !и рагс, Ьу сЬе шсгеазед ейктепсу оГ с1оиш8 с!таг гези1гз Гтош йе гйгесс соча!епс ассасЬтпеттс оГ с!ге сРЫА со йе чессот.
1.тЬгапез тиас)е ассогсйп8 со йе ог!8!па1 О1сауаша-Вегй ргососо) (1982, 1983) аге Вепегайу итос1егасе ш сотпр1ехйу апт1 Ьаче а ЫВЬ ргорогйоп оГ Гий-1епйй сРХАз. ТЬе сЬтеГ сйзатЬапсайе оГ гЬе оп8!па! ргогосо1 В йас й !з 1епййу, дешапд!п8, апд шчо!чед. Хеччег ргоседигез йас а1зо изе азупииеспсайу гат1ед р!аяпЫ со рпше зупсЬеяз оГ 6гзс-зсгапд сРХА аге шисЬ яшр1ег апд уте1д 1тЪгапез оГ ЬсВЬег сошр!ехйу (е.8., р!еазе зее Вейешаге еС а!. !991; 5р!с)соГз)су апд Магйо1з)сее 1991). ° Иапдот рптепп Ечеп сЬе Ъезс сРМА ПЪгапез сопсаш оп!у а япай ргорогйоп оГ Гий-1еп8й с1опез. 1Г йе зупйеыз оГ йгя-зсгапд сРХА чтаз шсошр!есе, йе с!опез мл11 !ас1с зет!иепсез Ггош йе 5' епд оГ сЬе шЕМА.
1Г зупгЬеыз оГ зесопд-зсгапд сРМА ччаз аггезсед ог Ыос)сед, йе 3' епт! оГ йе тпИХА ччй! Ье ипт)еггергезепсед ш йе ПЬгагу. ТЬезе ргоЫетиз сап Ье аше1ю- 1пггог)исгюп 11.13 гоге егяррр ггеас и(!П Ппаее Н аоб ОГГА ро!угоегеее ! ес„ %., 'о «горрр ъ — ~ -е ~ ~-- | ТТТТТТ ~ Ггееъ ю ГП Т4 ОНА ро!уоъегеее (яаъе Есор! аберъог Есо Гб абаръог Есор! аберъог бцея и)аа А(оГ! есор~обе Мог! вге Е!ъ ъ)ВЕ 11-2 Рг!пъ!и с0ЫАа ипй ап ОВ о(дТ) Ада Гог 1ог О!гес(!опа! С!опгп ТЬе ((гаг-а(гапб геасбоп о( с0МА асуп(Ьеа(а (а рг!гпеб Ьу о!(ео(дТ) ьег!оепсеа !)и!себ Со а рпгпег-абаргог епсоб)па а геяпс(гоп епбопис!еаье гесоеп(((оп я(е (!и йь саге, Хо(!). ТЬе ьег(оепсе о( гпК(ь(А !а гергеаепгеб Ьу еЬе со!огеб (ъч)ее!у) аггапб, ъчЬегеаа йе а!(ео(дТ)-абар(ог (а вЬоъчп )и Ыас(с.
Тгеа(гпепг о( Фе ИЧА-0ХА ЬуЬг(б ъи(Ь КЫаье Н апб 0МА ро1угпегаае ! пгс(са (Ье К(9А гпо(е(у, сгеа((пе 3'-Ьудгоху! (егппп! еЬаг аге оаед Ьу Т4 0МА ро!угпегаье (о согпр!еге (Ье аесопб-ьггапд аупйеяя (3еа(!оп о( ЕсоВ! адаргоге (о йе бооЫе-а(гапбед с0(ь(А ргобос( апд с!еачаае илй Хог! аПоъч ГЬе ргобос( (о Ье (паегсеб )и а б)гес(еб гпаппег )пго ап арргорпаге чесгог. гагед Ъу пяпц гапдогп о11аоппс1еог!г!ез (папа!!у Ьехагпега) аа рПгпега (р1еаае аее р(цпге 11- 3). Нои ечег, а1(ЬопрЬ (Ыа аггасеау гпау ао1че опе ргоЫегп, гг а)ао сгеасеа ойегя с0ХА с1опеа г)ег(чег( !гого гапг!огп рг(пт)па оу ()гаг-аггапг! с0)ъ(А геохи го Ъе япа11ег йап с!опеа г)ег(чед Тгопт о1!ао(г!Т) рг!пипа.
1п агЫ(Г(оп, йе еу()с(епсу оу рг(пт!па чаПех 1гогп опе ВХА Го апо(Ь- ег, г)ерепйпе оп ТЬе иге оГ йе гпВХА апд (Ье согпр1ехггу апг( согпрояг(оп оу йе галопу о1)цоппс1еог(г)е роо1. 11(Ье пае оГ гапдопт ргппега сгеасеа ргоЫегпя йеге аге а!(егпаг(че ъчауа го цепегаге сР)ъ)А с!опек сопга(п)па 5'- апг( 3'-геггп(па! геа(опа о1 птВМАя 1ог ехагпр1е, 5' ВАСЕ апг( 3' ВАСЕ (р!еаае бее СЬаргег 8, Ргогосо1а 9 апд 10). рог а аппппагу оу гпе(Ьода го ауп(Ьеяге Йгаг-аггапг! сРХА, р1еаке бее ТаЫе ! 1-2. 11.14 С)гаргег 11: Ргерагаг|оп оЕсРНА 1|)лгаг|еь апс) Сепе Ег|епгфсаг|оп П~7Яррр тгоррр |гвв! а|!в Е(Г|ввв Н апб и((А ро|утегввв | 'оррр ггвв! нот Т4 ПГВА ро(угпегввв Е!СРКЕ 11-3 цап!(от РПт|п о( соНАь 5упйеь(ь о( Вгь|-ягапд сЕМЧА 'ь!п|г|агег| Ьу гапг|оп! оццопис(ее!|в(еь, иьиаПу Ьехатегь (гергеьепгег) аь Ыас|! аггохнь) йа! аге ехгепг(ег( Ьу генегье ггапьспр|аье (ехгепь(оп ргог(ис(ь аге ьЬоччп аь со|огег| аггоъчь), Тгеа|гпеп! ьч|гЬ 8Наье Н апг( РЫА ро|угпегаье | п|с(гь (Ье 8НА апг| гера!гь царь !и йе сРНА.
5есопг(-ягапс| ьуп(Ьеь(ь (ь сагпег| ои! Ьу Та РЫА ро|упзегаье. Ьуп1!ле5!8 оЕ ЬесопсЕ-8$гапс! СОМА рог !папу уеагь, (Ьеге гчаь по еЕЕесЕ| е ччау о(Ьег гЬап ье1Е-рппипц го ьупгЬеяхе гЬе ьесопс1 ьггапг1 оЕ сРХА, апс1 а!тоь! а)1 с1опеь оЕ сРХА тас1е ЬеЕоге 1982 ччеге оЬга|пег) ияпу гЫь епхутагк геасг|оп (е.у., р1еаье ьее ЕЕягаг|айь е! а!. 1976; Н|цисЫ е! а1. 1976; Мап|аг|ь е! а1. 1976; Коицеоп апг) МасЬ 1976).
ТЬе ье!Е-рг!те!) ьупйеяь оЕ йе ьесопг! ягапг) оЕ сРХА лчаь а! Ьеь! а роог1у сои!го!)ег! геасг|оп, апс1 йе ьиЬьегрлеп! с!еачаце оЕ гЬе Ьалгр!и ьгплсгиге ъч|гЬ пис!еаье 51 а!гпоь! |пнапаЫу 1ег) го йе 1оьь ог геаггапцетеп! оЕ ьег)иепсеь соггеьропйпц го йе 5' !ест!пиь оЕ гЬе тК!х(А (1.апс1 е! а1. |981). Сопьегрлепг!у, йюь ьсЬете Еог ьупгЬеых!пц г|оиЫе-Ягапдед сР!х|А гпо1еси1еь Ьаь поъч Ъееп 1агуе1у гер!асег) Ьу тоге ейк|еп! апг)!еьь г)еыгисг!че тегЬог)ь (р1еаье ьее Ъе1оъч) гЬа! у!е18 10-100 г|теь юпоге сРХА с1опеь йап ье|Е-рппипц (0)сауата апг) Вегу |982; СиЫег апг( Но|!пап | 983). Тог!ау, ьесопс1-ьггапг1 ьупйеяь !ь иьиа11у сага!ухе!) Ъу Е.
сой Р|х(А ро1утегаье 1 апг1 Е. соц ВХаье Н. Ноччечег, о|Ьег епгутеь гпс!ийпц |ЬеггпоьгаЫе РХА ро1угпегаьеь ьисЬ аь Тй апг( Таг) аге а|во иьес1, а!Ьеп гаге!у. ТЬе сопйцопь иьег( го асЬгене ьупгЬеяь оЕ Еи11-1епц|Ь ьесопг1-ьггапг1 с13!х(А г)ерепг) оп йе раггки!аг РХА ро1утегаье. Веасг|опь йа! иье Е. соП Р)х)А ро1угпегаье 1 аге иьиа!1у сагг|ег) ои! а! рН 6.9 го пшшп|хе йе 5' — э3' ехопис1еаье асг|н|гу оЕ йе епгугпе апг! а! 15'С го гпшппгае гЬе роььгЪ|1Ьу оЕ ьупгЬеях|пу "ьпарЬас)с" РХА. ТЬеье ргоЫеть сап Ъе согпр1еге1у ачо!8ес) Ьу ияпц еЬЬег гечегье ггапьспргаье ог йе К1епочч Егаугпепг, Ьо(Ь оЕ лнЫсЬ )ас)с 5' — х3' ехопис!еаье асг|ч|гу апг) аге ача|!аЫе ш риге Еопп !гот сопипегсга1 ьоигсеь. Е.
сой РЫА 1гцаье |ь ьогпеогпеь !пс1ис1ег1 |п гЬе геаспоп Ъесаиье ечх)епсе игйсагеь гЬа! йе еЕЕгс|епсу оЕ 1пстотГисс(оп 11.15 ТАВЕЕ 11-2 Мейоба Ео 5уп(Ье|6ге Р!гас-асгап6 сР1ЧА Рпттц гчиБ ОЕ(ца(тЕТ) А|$ аа|ацс|| ЕЕ6с(еп| ап6 аппр1е. А)!оста и|е оЕ |Ье биЫег ап6 Нойшап (1983) ргоседше Еог зуп|Ьеа!а оЕ |Ье |есипов а|таад о( сРХА. Весаиае 6!ЕГегепт Пп1сега ог ас$арсога сап Ье асЫе6 а| еасЬ еп6 оЕ сЬс сРХА, сцгес6опа! с1оп(пц Ь роя|Ые ап|$ |Ьеге ы цгеат Пех|Ь|!пу ш сЬоке о( чес|ога. РЬа|$чап тацеп Ып1|егя таця ог абартога тиас Ье а|Ые|1 ЪеЕоге сЬе сРХА $| (паегсе6 1п|о |Ье чес|ог. Мапу ргоседигеа тес!шге |Ьа| йе ПоиЫе-асгап6ес$ сРХА Ьс 6!Вестей сч|й а геа|пс6оп епгу|пе(|) Ье$оге с1ошпц.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
