Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 97
Текст из файла (страница 97)
Ноъчечет, йе аЪг1Пу со геаст сопя)ятепс!у ъч!тЬ а рагбсц1аг ргоЪе, а1тЬоц8Ь ап епсоцга8!п8 апд песеяяагу ргорелу, ь пот яцП)с)епс то ргоче тЬас а 8!чеп сР)ъ)А с)опе ь т1епчет1 Ггош тЬе шКХА оГ !птегеят. ТЬе оп1у аЬяо1цте ргооГ оГ Ыепт)ту 1я го яЬоъч тЬаг тЬе сР)ъ)А с!опе соптагпя ап ореп геасПп8 Ггатпе гЬас епсот1ея йе епбге апцпо асЫ яес)цепсе оГ тЬе ртогегп. Япсе йь ь с1еаг!у ипргастка1 Гог пгояг рготетпя оГ сцггепс !птегеяг, ойег, 1еяя е1егпепга1, теяь шцяг Ъе цяед. ТЬеяе )пс1цде !п десгеаяп8 огдег оГ 68от: ° Ехртеяязоп Гтот г)геГиИ-Гепд~)г сР)ъ)А т рго)гагуот)с ог еи)татуо6с се!!я оГ а рготегп йат д)яр1ауя тЬе соггест Ью1о81са! ог епхугпатк асттчду. ° Соггеяротгдепсе Ьегъмеетт рогт1огтя оГ т)те пис1еогЫе яет1иепсе оГг)ге сРНА апд тЬе апппо асЫ яег!цепсея оГ рертЫея депчед Ггош гЬе рцпйед рготегп. ° Соггеяротгдепсе Ъетъчееп г)ге рер6де тара оу тяте ро!урертЫе яупгЬея!гед гп чдго Ъу тгапяспрь оГ гЬе сРХА с1опе апд рертЫе шаря оГ йе ашЬеп6с ргосе!и.
° 1ттипоргес1р1гаг1отг оГ г)те ро1урергттГе яуттт)тея1хед 1гг ч1гго ог т ч1чо Ггош гтапясгтргя оГ гЬе сР!ъ)А с!опе Ъу ап6ЬосПея гаьед а8а)пят гЬе рготе!и оГ !птегеят. ТЬе ягпп8епсу оГ гЬь теяг !псгеаяея ъчЬеп П ь сагпед оцт ъч!гЬ а яепея оГ пюпос!опа1 ап6ЪосПея йас гесо8п!хе дПГегепг ердорея оп гЬе рготегп. ° 1ттипоргес1рйаг1оп оГ т)ге аиг)гепт1с ргогет ъч!т)г атгт1Ьод1ея гаьед а8а)пят яупгЬегк рертЫея ъчЬояе яет)цепсея аге т1етегпппет1 Ъу тЬе пцс!ек асЫ яет)цепсе оГ йе с!опед сР)ь)А. !т ь еяяеп6а! йаг ГЬе Сея!я цяед Го ча1Ыате а сР)ь)А с1опе т1о пот тье тЬе яатпе геа8ептя тЬат ъчеге цяет1 го Ыепт)Гу гЬе с1опе !п тЬе Гггят р1асе.
!Г, Гог ехагпр!е, а с!опе ь яе1естед Ъу ясгееп)п8 а ПЬгагу чдтЬ ап6Ъот1у, П саппот Ье ча1Ыагед !п геятя тЬаг ге1у оп тЬе яаше ап6Ьот1у (яцсЬ ая )пппцпоргестрдатюп оГ ро!урергЫея яупйеяхед гп ч!!го Ггогп ггапяспрь оГ тЬе с!опе). 1п адд1- тюп, йе с!опед сРХА яЬоц1д ЬуЪпгПхе то шй)ь)А ъчЬояе я)хе, паяце, апт1 ярестея д)ятт)Ьц6оп аге сопяятепс ъч!гЬ гЬе яггцстцге апд Гцпс6оп оГ тЬе рготетп.
г!паПу, тЬе ргорет6ея оГ тЬе ро1урертЫе ргегПстед Ъу йе пис!еотЫе яет)цепсе оГ йе сРХА яЬоц!д Ье !п ассоЫ ълтЬ тЬояе оГ гЬе ацгЬепбс рготегп. Пот ехапгр!е, тЬе чая! тпа)опту оГ яесгегед ог р!аяпа гпегпЬгапе ргоге)пя аге депчед Ггош ро1урергЫе ргесцгяогя йаг саггу а ЬудгорЬоЬгс 68па! яет)цепсе ат гЬе!г апипо теггпшг. ТЬе аЪяепсе оГ яцсЬ а 68па1 Ггогп тЬе ргегПсгед ро!урергЫе ъчоц!д тЬегеГоге Ъе саияе Гог сопсегп. 8!шПаг1у, йе ргегПссед я!хе оГ тЬе ро1урертЫе, Пя очегаП сЬаг8е апд апцпо асЫ сошроя16оп, тЬе пцгпЬег оГ росепба1 8!усояу!аг!оп ятея, апд гЬе ргеяепсе оГ Ьут1горЬоЪгс ге81опя йат сои!д яегче ая тгапяшегпЬгапе апсЬогя яЬоц!д Ье сопя!ятепс ългЬ йе )споъчп ргорег6ея оГ тЬе ацтЬептк рготегп.
11.3б СЬаргег 11: Ргерага6оп ог сРИА 1.)Ьгаг1ег апс! Сепе Иепгфсаг1оп РКОТОСОЬй РОК ТНЕ РКЕРАКАТ1ОЬ! АЬ!О АЬ!А1Лгй!$ ОГ с0Ь!А ТЬе со1!есбоп оургогосо1а !и гЬЬ сЬаргег га ргевепгег! ш гопг раггя ° Ргогосо1 1 ь а сгаг!!6опа1 ргогосо! уог гЬе сопаггпсг!оп оу сРХА 11Ъгаг!еа гп ЪасгепорЬаце Х чесгога (1ог гЬе шчеаг!цагог ччЬо с!оеа пог Ьаче ассеаа го Ыга). ТЬЬ ргогосо!, ччЬ1сЬ !а Ъааес! оп йе Спццег-Но)угпап шегЬог! (СпЫег апг! Ноугшап 1983), !а йчЫед шго ях ьгацея 5гаце 1: 5упгЬеяз оГ Е)гаг-аггапс! сРХА Сага!утес! Ьу Еечегае Тгапасг!ргаае 5гаце 2: 5есопс1-аггапг! сРХА 5упгЬеяа Маце 3: МегЬу1аг!оп оусРХА Маце 4: АпасЬшепг оуЕ!п)сега ог Аг!ар!ига Маце 5: Егас6опа6оп оГ сРХА Ьу Се! Е!!сгагюп гЬгопцЬ церЬагоае СЕ-4В Маце 6: Е)цаг!оп ог" сРХА го ВасгепорЬаце 1. Агшз ° Ргогосо! 2 (яш11аг го ргогосо! 1) 1а гог гЬе сопягпс6оп апс! асгееп!иц оГ а сРЫА ЕЬгагу ги еп1сагуоггс ехргеаа!оп чесгогя Маце 1: Сопягпс6оп о1 сРХА Е)Ъгаг)еа ги Еп1сагуо6с Ехргеаа!оп Чесгога Маце 2: 5сгеепшц сРЪ)А Е!Ъгаг!еь Сопаггпсгег! ш Еи!сагуог!с Ехргеьяоп Чесгога ° Ргогосо! 3 !а а шегЬод уог цепе Ыеп66са6оп пяпц ехоп агпр11Всаг!оп.
Маце 1: Сопаггпсг)оп ог гЬе Е|Ьгагу Маце 2: Е1есггорога6оп оу йе 1лЪгагу гпго С05-7 Се!Ь Маце 3: Нагчеаг)пц ог гЬе шЕХА Маце 4: ЕТ-РСВ Апа!уа!а Маце 5: С1опе Апа1уяь ° Ргогосо1 4 !а паес) уог цепе Ыеп66са6оп Ьу с!!гесг ае!есг!оп ог сРХА. ! саппог ипсгегггапс! гчЬаг тагсег гс1епгиь 6сЕ ТЬеу аге а!вауз ччгопц апс! а!чеауг до оп. Яг Егес! Ноу1е Ргосого! !г 5гиее 7: Яуп(Ьеыь и! Г!гьг-ьсгилг( сР)|ГА Сага(ухе|7 Ьу КТ 7!.39 АГКСГ, (7 м) Тпь-С! (7 М, рН 6.3 а( гоот Гетрега(оге) Епгуепе5 ап41 Войеу5 Кечегье Сгальслр(аье КесошЬ|папс ишппе гечегзе сгапзспрсазе Ь ачаааЫе Егосп зечега1 шапиЕасыгегз. )Че а|гопы!у гесоп|- гпеп6 |Ье ые оЕ а гписасед Еопп аЕ сЬе епгу|ие сЬас 1ас)сз Кг !азе Н ас6чиу (е.ц., 5ирегзспрс 11 гечегзе сгапзспрсазе Егош ЫЕе ТесЬпо!о5(ез).
Аз йзсияе6 ш |Ье (пГоппа6оп рапе! оп |Ье Мо-МЕЧ КЕЧЕК5Е ТКАМ5СК!РТА5Е, |Ье зрес|6с асбйсу оГ ргерагабопз оЕ гечегзе сгапзспрсазе 6ерспбз оп сЬе рагски!аг сРМА с!опе пьес! со ехргея йе епгуше ш К со!|'. Гоао|ч йе шйчйиа1 |папиЕассигег'з йгессюпз (|.е., ип|ь)05 |прш ро1у(А)' КМА ап6 !псиЬабоп сешрегаыге) Гог |Ье епгуп|е ас Ьапа, Гог а|Ыиюпа1 (п(огшабоп, р!сазе зее йе рапе1 оп ТКОРВЕЕ5НООТ!МС| ОРТ!МШМС НК5Т-5ТКАМ0 СОМА 5УМТНЕ5!5 ас йе еп6 оЕй|з ргососо1. Мо-Мlи КТ (з сеспрегасиге-зепз(6че ап6 зЬои!6 Ье зсоге6 ас — 20'С ип61 пеебе6 ас йе еи6 оГ 5сер !.
ИЧаье !лЬгЬЕ(ог (ор(!ола!) Ргосе(п (пЬ|Ъиогз оГ КМазе Ь|п|1 со ап|1 !пЬ|Ь|с сЬе асс!ч(су оГ и|озс КМазез Ьш |)о пос а(Гесс |Ье КМазе Н асичиу оГ Мо-МЕЧ КТ. ТЬезе шЫЬ|согз аге зо16 Ьу зечега1 шапиЕасшгегз побег чапоы !сабе паше| (е.5., КМАяп, Ргоше5а ап6 Рг!гпе 1пЫЬиог, 5 Рпп|е — гь Ргипе).
Гог |поги с(есааз, р1еазе зее йе |пЕогп|абоп рапе) оп ГМН!В!ТОК5 ОГ КМАЬЕЬ 1п СЬаргег 7. )Мос!е1с АС1415 апд О!коппс!ео1141е5 гГМТР ьо!ипол пол(а(л(ле аП Гоиг сГМТРь, еасЬ ас 5 тАГ ОГ(полис(еос(сГе рптегь Гог сРМА ьул(Ьеспь (7 теут!) 5УпйеЯз оГ 6гзс-Ягап6 сРМА Ь ВепегаПУ Рг(шеб ЬУ гапбош Ьехагиегз, о65о(ЙТ) и |и ог а пихшге оЕ йе с|чо. Гог йгесбопа! с! оп1и5, рг(шегабарсогз оЕ |Ье Вепега! зсп|ссше ' р(|1Х) — (с(К) — (6Т) „-ОН' аге ысй |чЬеге Х = а с1ашр сошрозе6 оЕ Еоиг пис!еосЫез (ыиаПу САСА), К = а гесо5п(сюп ясе Еог а гезсгксюп епгугпе, ап6 (6Т), = а Ьогпоро!ушегк гип оГ 15 6Т гез(6иез изе6 Еог йгессюпа! с!оп!и5.
ОПВо(с)Т)п и Рлп|егз аге Ргезепс |п сЬе Гсгзс-зсгап6 геас6оп иихсиге ас а !О-Го!6 (Мо-МЪН Н ) со 40- Ео!6 (Мо-МЕЧ) п|о!аг ехсея. РпП)се гапбогп Ьехагпегз ап6 рг(гпег-а6арсогз (р)еазе зее Ъе!озч), |Ье сопсепсгаиоп оЕ оПВо(6Т) п,з рпгпегз ВепегаПу |1оез пос пее6 со Ье орбпиге6 |п йе геас6оп пихсше. ТЬе сопсепсгабоп оЕ гапбогп Ьехагпегз ш сЬе геассюп пихшге Ь спска1.
Аз йе га6о оЕ Ьехап|егз со |пКМА Ысгеазез, йе ачега5е !еп5|Ь оГ сЬе сРМА 6есгеазез. !с Ь йегсЕоге еззеп6а! со ор6пиге йе гасю оГ гап6ош ргипегз ап6 гпКМА сеп|р!асс |п а зеле| оЕ р|1ос геассюпз сопсашш5 гайо!аЬе!е6 ЙСТР. ТЬе ачега5е яге оЕ йе Гсгзс-зсгап6 сРМА Кепегасеб |п еасЬ оГ йе РПос геассюпз зЬои!6 Ье п|еазиге6 Ъу аПса1ше а5агозе Ве! е1ессгорЬогезЬ ап6 аисогайо5гарЬу ияп5 РМА спаг1|егз оЕ Кпо|чп яге. С|гЬеп зесс(п5 ир а 1аг5е-зса1е геас6оп со зупйезае Гггзс-ассалам сРМА, ые сЬе ЫВЬезс га6о оЕ гаибосп рпгпег со шКМА йас Кепегасез сРМА оЕ йе п|ахипшп ачега5е !еп5|Ь.
Рг(шег-абарсогз аге КепегаПу 1ея сгоиЫезоп|е йап гапбоы ргипегз. Носчечег, (с Ь печеяЬе!ея рги6епс со орс!пые йе гасю оЕ рп|пег-а|)арсогз ап6 |пКМА сегпр1асе ш а зеле| оЕ раос геасиопз солса!п|п5 гайо!аЬе1е6 6СТР. Меазше йе ашоипс оЕ сРМА зупйеяге6 ш еасЬ геассюп аз оийпе6 |п 5серз 5 ап6 о оЕ йи ргососо1. )чЬеп чесс(п5 ир а!аг5е-зса!е геасбоп со зупсЬеяге Есгзс-зсгапд сРМА, ые йе 1о|чея гасю оЕ ргипег а|)арсог со п|КМА йас Вепегасез сЬе п|ахипшп у|е16 оГ сРМА.
Ргераге зсос1| зоЬп!опз оЕ рпп|егз (! шиш! |п 10 гпм ТгЬС! [РН 74]). сиоге а1ирюк о( |Ье зо!и6опз ас — 70'С. Ро!у(А) )ГМА (7 от!) Арргохппасе!у Ь вЂ” 10 05 оГ ро!у(АР КМА Ь гег)и(гед со зупйеяхс епоиВЬ 6оиЫе-зсгапбе6 сР1чА со сопягисс а 1аг5е ПЬгагу. (Опе сопбиепс 90-пип р1асе оЕ си!|ые6 шапипаПап сеПз у(е16з ! — 2 05 оГ ро!у(А) ч КМА ) ТЬе зупй|еис геас6оы |ч!П з66 |чог1| |Е 1ея сегпр! асс и ачаааЫе, Ъш сЬе! ояез оЕ сРМА ас еасЬ зса5е (и |Ье ргососо! |чП! Ье ргорогсюпасе1у Кгеасег. Гог аяЬсапсе |чЬеп ргерапп5 а сРМА ПЬгагу Егош а 1|ш|се6 пишЪег оГ сеПз, р!еазе зее йе )п(огыа6оп рапе! оп СОМ5ТКОСТ(МС сРМА ОВКАК! Е5 ГКОМ 5МАЕЕ М()МВЕК5 ОГ СЕ! 65 ас сЬе сп6 оЕ |ЬЬ сЬарсег.
Ве(оге Ъе5(ппш5 сопягиссюп оЕ йе сРМА ПЬгагу, сЬе (псе5г(су оЕ йе ро1у(А) КМА со Ъе ые6 зЬои!6 ЫеаПу Ье сЬес)се6 Ьу (!) а5агозе Ке! е!ессгорЬогеяз ап6 погсЬегп ЬуЬгЫ1гас|оп |чпЬ а сопсго! ргоЬе (р!сазе зее СЬарсег 7, Ргососо1з 5 апд 8), (2) сгапз!апоп |п а сеП-Егее зузсеп| Еоаоъче|1 Ьу 505-ро!уасгу1а|пЫе Ве! е!ессгорЬогеяз оЕ йе геы16п5 ро1урерсЫез, ап6 (3) апа1уза оГ йе яге оЕ сЬе 6гя зсгапд оГ сРМА зупсЬеяге6 (и а РПос геасиоп (р!еазе зее йе рапе1 оп ТКО()ВЕЕ5НООТ!МС| ОРТ1М!ЛМС Г!К5Т-5ТКАМР сРМА 5УМТНЕ5!5 ас йе еп6 о! й|з ргососо1).
11.40 СЬарсет 11: Ртератапоп о7 сРИА Е!Ьтат)еь апсЕ Сепе 1Йепсфсаг)оп КагьспаСТЕСЕЕ СОГПРООПСЬ Еа-32Р)г)СТР Е70 тСЬл), 400 Итто1е) <1> ]а зср! с1АЕР апс) ] а яр! с)ТТР зЬои1с1 пос Ье изес) аз сатНюасбте сгасегз со гпошсог зупйез)з оЕ йе Нгзс апс) зесопс) зсгапс)з оЕ сРНА, япсе йеу псау Ье спсогрогасесС ргеЕегеппаНу шсо сР)4А с)ег!чесс Егош сЬе ро1у!А)ч стас! ас йе 3' сеппспиз оЕ сЬе шКНА. ВассЬез оЕ ]а-яр! НСТР >2 счееКз о14 зЬои14 пос Ье изес) сп сЬсз ргососо!. ТЬачч с1се !а-ЯР]с)СТР )изс ЬеЕоге зсагпп8 йе ргососо!.
5соге йе сЬасчеН гатНо1аЬе1еН дСТР оп ке ипи1 пеес)ес) сп 5сер 2. Кесигп сЬе гас)со1аЪе!ес) с)СТР со йе Егеекег )шшесс)асс!у ааег ые. А !МРОКТА)с)Т ТЬе 5сгасааепе сОЫА 5упйеь!ь К)с гесотгпепс)ь йе иье о! апу )аЬе! ойет йап с)СТР сМСЬ )Сь ргогосо!. ТЫь )с)С )пс!ис1еь 5-тпейу) с)СТР !и СЬе с)ЬСТР пихеь Со ргогесг йе СОМА ада)пьС с1еачаце ас !псегпа) яСеь Ьу ХЬо), ччЬ)сЬ !ь пьес) со ге!еаье ХЛос епс)ь Еог Нцапоп, ТЛе иье оЕ гас))о)аЬе!ес) с)СТР тйй СЬе 51гагаеепе ргогосо! сои!с1 сгеаге ипртогесгес1 ХЬос ь!Сеь тМСЫп СЬе СОМА ьес!иепсе. АЕЫ!1сопа! Кеацеп15 5сер 5 оусЛсь ртососо) тес)и)теь Яе теаеепсь 1)ьСес) т СЛарсет 5, Ртососо! В, МЕТНО0 АсЫ йе спапиуассигег'ь гесотспепс!ес! агпоипс оЕ Мо-МЕУ Н КТ со сЬе геасс!оп. Мсх сЬе геацепсь ччеП Ъу цепс!е чогсехшц.
Тгу со ачоЫ ргойсс)п8 ЬиЬЫез, а1сЬоиНЬ сЬсз Ь зошепшез сИйси1с Ьесаизе КТ ы зиррНеН сп ЬссЕЕегз сопсашсп8 Тпсоп Х-100 ог ХопЫес Р-40 апсС 509о 81усего!.!1 песемагу, гепсоче ЬиЪЫез Ьу ЬпеЕ сепспуихапоп сп а шссгосихе. Мо-МЕСТ КТ Ь сепсрегасиге-зепяссче ассд зЬои14 Ье зсогес) ас — 20'С ип01 пеес1есс. 4с !МРОКТАЬСТ 1Е а ргерагаЬоп ос АМН КТ !ь пью, р!еаье ьее ТаЫе 11-3 Еог геасгюп сопйсюпь, 2. АЕсег а!! оЕ йе согпропепсз оЕ сЬе геасНоп Ьаче Ьееп ппхес! ас 0"С, сгапьЕег 2.5 Н! оЕ сЬе геассюп со а ЕгеьЬ 05-гп! гп]сгоЕике сиЬе.
АсЫ О. 1 Н1 оЕ [и-3~Р] с!СТР (400 Сс/пппо1е, 10 гпС11гп!) со йе япа!1-ьса1е геассюп. Яресса! Ецо!рпсеп$ М!стоуиае сиЬеь, ЙА)аье-Етее Яагет Ьайь ртеьеС Со 76'С апс) 70'С 1. То ьупйеяхе 6гьс-ьсгапс! сЕ))ч)А, ппх йе ! НК/Н! Ро1уЕА)" КС4А 1 Н8/Н) оНВопис1еоСЫе рпспег!з) 1 М ТгтяС! ЕРН 8.0 аг 37'С) 1м КС! 250 шм МНС! зо1шюп оЕ аН Еоиг с114ТРь, еасЬ ас 5 псм О.! М тНйюйге)Со! КНазе спЫЬпог Еорпопа!) Нсо Е011оиг)пц ю а ьсег1!е ппсгоЕице сиЬе оп ке: !О н) 1 н! 2.5 н) 3.5 н! 2 н! !0 н! 2 н) 25 ипЬз Со 48 Н! Реп!ого! )с $га8е 1: $упсЬез(з о) Рггзг-зсгапг) гЕ)ЮА Сага!угег( Ьу ВТ 11.41 3. !псиЬасе сЬе!аг8е- аис1 яиаП-зса1е геассюпз Еог 1 Ьопг ас 37"С. Н)8Ьег сегпрегасигез (ир со 55'С) сап Ье вазед чдсЬ юпсе ишсапс Еоггпз оЕ Мо-МРЕ К!'. 5упсЬеяз ас ЫКЬег сего регаьлгез сап шсгеазе сЬе у)е1д оЕ еРХА Сгопс тКЬСА сепср! асез сЬас сопсаги ехсепзйе зееопдагу зсгоесиге.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
