Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 100
Текст из файла (страница 100)
ТЫх атгасе8у Ь гьес) ш сР)х)А ьуптЬеяз рбь хо)6 Ьу 5тгата8епе. 1Е тЬе сР)х)А ь шетЬу!асет1 Ьу шсогрогаооп оЕ 5'шетЬу!6еохусутох(пе, Ь ь еааепт(а! то ихе а хтгаш оЕ Е. со1т тЬат ь т(еЕтс(епт 1и гЬе итог гехггктюп хухгеш, тчЬкЬ погтпа11у с1еанев РХА ат шейу!сутояпе тех(т)иех (Ка1е18Ь ет а1. 1988; ЪЧоот(сос)с ет а1. 1989). ° (Ле ЕсоК1 шегЬу1аве то сага!уге гЬе тгапхЕег оЕ шейу! 8гоирх Егош а с1опог аисЬ аз 5-ат1епоху1шетЫопше го тЬе хесопт( оЕ гЬе ттчо ас1ептпе геят(иех 1и йе гесо8пгбоп хет)иепсе оЕ ЕсоК!.
ТЬе шос66саьоп оЕ ат)ешпе то 6-тпейу1атпшориппе рготесь йе РЫА Егош с1еача8е Ъу ЕсоК! (Сгеепе ег а!. 1975). ЕсоК1 шетЬу1ахе ы ап еЕ6степт епгуше апт( тч111 ихиа11у шейу1ате тЬе чахл ша)огьу оЕ ятех тп тЬе сР)х)А. 5рест6с итейу!атюп 8епега!1у аЕЕогЖ тЬе таг8ет ает)иепсе а Ы8Ь т)е8гее оЕ рготесбоп а8а(пхт ялЬхет)иепт с!еача8е Ьу йе со8пате геатпсг(оп епгутпе. Нолчечег, Ьесаиае йе ЕсоК1 шегЬу1ахе ь (пЬ(Ь1гет) Ьу М8л, 11 ь ехаеп6а! то ргестртсате тЬе сР)х)А тч)тЬ ейапо1 то с1еапхе тЬе ргерага6оп оЕ М8л' ЬеЕоге ргосеесбп8 чбй тпейу1атюп (5терх 11-14 оЕ 5та8е 2).
Ъй~еп еяаЫьЬтп8 сР)х)А!1Ьгапех Егош чету япаП ашоиптх оЕ шК)х)А, тюше шчехт(8асогх аьетпрт то тпах)инге йе пшиЬег оЕ сРХА с1опеа Ьу яшр1у опиьш8 йе шейу!а6оп атер (е.8., р!еахе аее МсРоппе!1 ет а1. 1987; Роп ес а1. 1993). ТЬ(х арргоасЬ хийегх Егош йе т1ЬатЬ апта8е тЬат сР)4Аа сопташш8 "пашга1" 1птегпа1 ЕсоК! ятех аге с1еачет( Ьу ЕсоК! (пго ттчо ог тпоге Ега8- шепь апт! с1опед аерагате!у. МАТБ!!А! Б САОТЮ!х(: Р1еаае аее Арреит()х 12 Еог арргорг1а1е Ьаи611и8 оЕ ша1ег1а1а шаг)тет) тч1й (! >. ВоЕЕег8 аот! 6о!и6оп8 Р!еаае хее Аррепсбх 1 Еог сошроиеиЬ оЕ а(осЬ ао1и1юпя Ьи((егя апт) геа8еп1я 011и1е а1ос(т ао1и6опа Ео йе арргорпа1е сопсеп1га6опя СИого!опи <1> 10х ЕсоИ ЬиЕЕег 10х ЕсоИ тиетЬу1ахе ЬиЕЕег (ОрьопаИ 1Е т(еятетл, ите ш р!асе о( ГЬе ТияС1, !хаС!, апд ЕЕЛТА ит 5тер 1.
ЕОТА (0.5 Ат, рН 8.0) ЕтЬапо) 2850 СЬаргег 11г Ргерагагсоп о)' сРИА Е)Ьгагсег апг) Бепе Ыеп фспс!оп 3. АгЫ 2 сс! о! ЕсоИ гпесЬу!аае (80,000 писсайп!) со сЬе гешашг1ег о!йе геас6оп гшхсиге апг1 сЬеп а!иге сЬе геасОоп иихсиге ас 0"С пи!11 5сер 4 ь сошр1есег1. 4. Кепюче сгчо агЫЬюпа! а1!г)иосз !2 )с! еасЬ) !гоги сЬе !аг8е-аса1е геасНоп апг) р1асе еасЬ )и а аерагасе 05-гп! писго!08е сиЪе. ИшпЬег сЬеае шЬеа 3 апг! 4.
5. То еасЬ ог йе сонг япа11 а11г)писа (5сера 2 апг) 4), асЫ 100 п8 оу р1аяпЫ РИА ог 500 п8 01 ЬассепорЬа8е Х РИА, ргерагегс аа гсеасг)Ьегс ш МасеПа1я ТЬеае ппшесЬу1асегс РИАЗ аге иаегс аа аиЪасгасеа ш рг!ос геассюпа со асьау с!се еу)к!епсу оу псесЬу!акоп, яг !МРОКТАИТ Оо пог асЫ апу РИА Со йе !аг8е-пса!е геасиоп! 6.
1псиЪасе а11 Соиг рс1ос геас6опа апг! йе !аг8е-аса1е геасОои Сог 1 Ьош ас 37'С. 7. Неас йе Йче геассюпа со 68"С уог ! 5 пипшеа. Ехсгасс йе )аг8е-аса!е геассюп опсе гчссЬ рЬепоЬсЫого1опп апг! опсе гч)сЬ сЫого1опп. 8. То йе 1аг8е-аса1е геассюп агЫ 0.1 чо1шпе ог 3 м аойшп асесасе (рН 5.2) апгс 2 чо1шпеа оу ейапо1. Мсх сЬе геа8епса гче11 апг1 а!иге йе есЬапо!к ао1шюп ас -20"С чпсс1 йе геап1ь оу сЬе рг1ос геасс!опа аге ача1!аЬ4е. 9. Апа!ухе йе Гопг рс!ос геасНопз аа Т01!огчя а.
То еасЬ сопсго1 геасНоп, агЫ: 03 ММ8С1, 2 и! 10х Егор! Ьпууег 2 и! Н,О Со 20 П! Ь. АгЫ 20 ппЕь оу Есина! со геассюпа 2 апгс 4. с. 1псиЬасе а11 моиг аашр1еа Сог 1 Ьоиг ас 37'С, апгс апа!уге сЬеш Ьу е1ессгорЬогеяа йгои8Ь а 19е а8агоае 8е1. Аусег асагмп8 йе а8агоае 8е! ч8й есЛсйшп Ьгопг!де, сЬе сууИА сап ойеп Ье аееп аа а ЬаеСг8гоппгС япеаг гп сЛе 8е1. ТЛе гпесЛу!асегС сРИА СапгС йе р1аяпЫ ог ЬаесепорЬа8е Х САНА си ТпЬеа 3 ап8 4) аЬоиЫ Ье геяасапс со с1еача8е Ьу Есор! апгС аЬогч по сЬап8е Ы яге.
ТЬе ппшесЬу!асад еВИА апгС сЬе р!аяпЫ ог ЬассепорЬа8е 12ИА си ТпЬеа ! апгС 2 вЬопЫ Ье с1еачег! Ьу Его81. 1Г Ьой оНЬеае ехреееаеюпа аге СЬ!611егс, ргосеег1 Со 5Сер 10; 11СЛеу аге пог, гереас сЬе гпесЬу1аиоп геассюп. 1О. геесочег йе ргесср)сасегс сРИА (5сер 8) Ьу сепсгсуи8ас!оп ас гпахипшп ареегс Тог 15 шсписеа ас 4'С 1и а писгойл8е.
Кепсоче сЬе аирегпасапс, агЫ 200 сс! 01 7095 есЬапо! со сЬе ре11ес, апг! сепсг!Т08е а8аш. 11. Рае а Ьапг)-Ье18 пишгпопЬог со сЬес14 сЬас а1! о!сЬе гас!)пасс!ус!у ь гесочегег1 си йе реПес. Кешоче сЬе ейапо! Ъу 8епс1е аарсгайоп, г1гу сЬе ре11ес ш йе аи; апг! сЬеп йгьо1че сЬе РИА сп 29 Сс! 0!ТЕ (рН 8.0). 12. Ргосеегс аа аооп аз ь ГеаяЫе со сЬе пехс зса8е си сЬе аупсЬеяа ог сЬе сРИА. Ргогосо! 1: цгацег 4: АггасЬтепг оГЕтЕегз огАг)аргогя !1.51 СТАСЕ 4: АйаСЬтЕП$ ОТ ЙП1СЕГЬ ОГ АдаР1ОГЦ цечега) ПгТГегепг !урез оГ оццопис1еоги!е Пп1сегя ог ас!аргогя пгау Ье ияес) го сопяггисг сРГ4А ПЪгаг!ея.
ТЬе ытр!еы оГ аП аге ипаг)огпеП оПцопис1еог!с)ея (гур!сацу Ггот 8 го 12 пис1еогк!ея ш 1епцгЬ), ячЬояе яес!иепсе сои!а!пя а гесоцпцюп ыге Гог а геягНсПоп епгуте яисЬ ая ЕсоК1 15'- рСС6~ТТСССС-3'). ТЬеяе я!пц1е-яггапдег! оПцопис!еог!г!ея аге г!ея!цпег! го аппеа) яч!гЬ опе апогЬег го Гогт доиЫе-яггапс)ег! Пп)сегя ГЬаг сап Ье Пцагег) со гЬе роПяЬег! епг)я оГ доиЫеяггапг)ег) сРМАя. РиНпц йе 1гцагюп геасгюп, йе ПпЬегя аге аяяетЫег! шго ргоцгеяыче1у 1опцег ро1угпегя оп еасЬ епд оГ гЬе сРЬ)А. ТЬе ргог!исгя оГ йе геасгюп аге йеп с1еачес) Ъу гЬе арргорНаге геягНсПоп епхуте !!и йЬ саяе Есор го геточе ехсеяя!ш)сегя апс) го ехрояе соЬея1~ е гегпит аг гЬе епг!я оГ гЬе сРЬ)А (р1еаяе яее Е!циге 11-!4).
С!еаг1у, апу "па!ига!" ЕсоК1 ыгея гп гЬе сРЫАя йас Ьаче пос Ъееп ргогесгег! Ьу гпейу1агюп гп цгаце 3 аге чи1пегаЫе со аггас1с Ъу йе геяггкпоп епхуте. С!еачаце аг !пгегпа! ыгея !я опрея!гаЫе Ъесаияе сРМАя аге г!!ч!г!ег! !пго пчо ог гпоге Ггацтепгя, ячЬкЬ Ъесоте яерагагег) г!иг!пц йе с1отпц ргосеяя, апг) Ъесаияе сЬипеНс гпо1еси1ея тау Ье сгеасег) Ггот Ггацтепгя оГ сРЫАя с)ег)чей Ггогп !пс)ерепг!епг тК)з)А гегпр1агея.
ТЬеяе ргоЫетя ъчгП пог Ье Ьойегяопге гГ йе тегЬу!агюп геасПоп 15гаце 3) Ьая цопе ячеП. ТЬе рогепПа1 сотр1каПопя оГ шгегпа1 с1еачаце сап Ье яирргеяяег! Ьу иыпц аПаргогя гайег йап Пп1сегя. Ас)аргогя изей !п сР!я)А с1отпц аге яЬогг с)оиЫе-я!гадес! яупйегк о1гцопис!еог!г)ея гЬаг саггу ап !пгегпа! геягисгюп епс1опис!еаяе гесоцтгюп ыге апг! а ргоггисцпц гегпипия аг опе епй Гог ехатр1е: 5'-ААТТССССОССССОТСОАС-3' 3'-ССССССОСССАССТСр-5' !зоге гЬас йе г!оиЫе-яггапс)ес) яггисгиге сопга!пя ап ЕсоК1 соЬеыче [егпипиы !пгегпа! №Л апс1 цггй ыгея, апд оп1у опе рЬоярЬогу1агес1 5' гегпипиы Опе ас1аргог пю1еси!е сап Ье Пцагес) го еасЬ епс1 оГ а Ыипг-епг!ес) г)оиЫе-яггапс)ег! сР)я)А пю!еси1е. Т)пП)се !ш1сегя, ас)аргогя аге ипаЫе со Гогт пш!гипегя Ьесаияе гЬе ргоггиП!пц я!пц1е-яггапс)ег! соЬеыче гегт!пия!ас)гя а 5'-рЬоярЬаге цгоир.
ТЬе сРЬ)А то!еси1ея гЬегеГоге Ъесопге еои!ррег) яч!ГЬ Пче ЕсоК! гегпши яч!гЬоиг гЬе песеяыгу Гог йцеяцоп Ьу ЕсоК1. Ноъчечег, сРЬ)Ая тос)гТгед Ьу гЬе ас)сцгюп оГ аг!аргогя аг ЪогЬ епг!я пшяг Ье рЬоярЬогу1агег! ЪеГоге Пцаг!оп го а с)ерЬоярЬогу!агег! р!аят!с) ог ЪассепорЬаце Х чесгог РМА. Весаияе гесоцпцюп ыгея Гог №г! апя! 5а11 оссиг чегу гаге!у гп тапнпаПап РЬ)А (р1еаяе яее Аррепйх 6), йеу аге ип!Пхе1у го Ъе ргеяепс яч!ГЫп а сРМА яег)иепсе.
С1еачаце оГ йе с1опег! Р)4А яч!гЬ опе оГ гЬеяе епхугпея сап йегеГоге Ъе ияег! !п пюяг саяея со ге1еаяе йе шгасг сРМА шяегг Ггот йе чесгог. ОГЬег !урез оГ аг!аргогя регппг ехсеПепг а1гегпагпе яггагец!ея со Ье ияег! ячЬеп Пцаг!пц сРМА пю1еси1ея го гЬе!г чесгогя. Еог ехатр!е, йе гесеяяег) 3' сегт!и! сгеагег) Ьу йцеягюп оГ а чесгог Ьу ХЬо1 тау Ье рагг!аПу ППег! Ьу асЫ!г!оп оГ а с1еохуйуписцпе геыг)ие. РЬоярЬогу!асей аг!арсогя ъч!гЬ йгее-Ъаяе ргоггисПпц гегт!и! согпр1егпепгагу го гЬе рагПацу Ггцед ХЬо! ыге аге аггасЬег) го йе сРЬ)А. 14е!гЬег гЬе чесгог пог гЬе сРЬГА гпо1еси1ея сап аппеа1 го гЬетяе!чея, Ъиг гЬеу сап )о!и еГБс!епг1у го еасЬ огЬег.
Весаияе гЬе Х)го! ыге ь гецепегагей йе с!опег! сРМА сап Ъе гесочегега Ьу йцеяг!оп зч!ГЬ ХЬо1. ТЬЬ яггагецу цгеаг1у ипргочея йе ейк!епсу оГ гЬе Пцаг!оп ыер !и сРЫА с1отпц апг! е1гпипагея йе пеег! го гпейу!аге гЬе сРЬ)А ог го с)!цеяг Ь яч!ГЬ геыгкПоп епхутея ЬеГоге шяегПоп гпго йе чесгог ! гапц ег а1. 1986; ЕПефе ег а1.
1991). ЪУЬеп )о!тпц 1ш)сегя ог ас!аргогя го Ыипг-епг!ег! с)оиЫе-яггапг)ед сРЫА то!еси1ея, К Ь ппроггапг ГЬаг гЬе 1гцаПоп геасбоп Ье сагНе<! оиг ш ая ыпаП а чо1шпе ая розане !го та!пгаш а 11.52 СЬаргет 11; Ртератаг!ои о! сРИА 1,!Ьтатгет аид Сене 111еиггрсаг!ои Есой! КпКег врсс ' тв ' авгун 'онаа' . ' с'р дде1е апКегв 1о!вгде1 ОМЯ св!пд Ыдп сопсеп1гебопв оГ Т4 ОИЯ древе сс,, асс ',, а аа ', саа, с с: асс ' ° . а а, ' са Фс -: с а~дев! тп1П Есой! с сЯ 'он | аа~ф$ од 5 р аде!в и1!П дпевптеб р1вв!п1б тес!о! сену~од Есой! !его!1п~ 5'р вон с НС11КЕ 11-14 Аг!б!!!оп о1 1лп!тегв апг! Аг!а готе го РопЫе-вггапг!ет! сРХА Ргог!ос!в Ь1ЕЬ сопсепсгаг!оп ОГ!!О1сег-адар!оса).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
