Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 101
Текст из файла (страница 101)
ТЬе гпо1аг сопсепггаг!Оп оу 1!п!сег-а!!аргоса пплв! Ье аг 1еавг 100 г!гпев агеагег гЬап !Ье сопсепсгаг!Оп оу гегппп! оу сР!к!А !о ппппптае Ыппг-епг! 1!дат!оп оу сРХА пю1есп1ев. р!па!!у, Ъегоге гЬе сРХА !в швеггег! ш!о 1Ье Тес!от, ппгеасте11 ат!аргоса ап11 гЬе !о!у-то1есп1аг-ануе!ЕЬг ргог1псгв сгеагег! Ьу геягг!сгюп епаугпе г!1цевг!оп оуро!утес!ее!! 1!п1гегз пшвг Ье е16сгепг1у гетоуег1 Ьу со1шпп сЬготагоагарЬу ог ае! е!ессгорЬогев!в. А РЬоврЬогу!аге!! с!есагпепс дп11ег сои!а!п!па а гесоап!1!оп в!1е 1ог Есой! !в !!Еагеб 1о Ыип1-епбеб гагдег гпо!ест!ев, восЬ аа а ргерагадоп о1 боиЫе-вгтапбеб сРП!А. ТЬе гатаег гпо!есЫев аге !Ьеп ргерагеб 1ог с!оп!па Ьу б!Еевг!оп ипгЬ Есой!.
11.54 СЬарсег 11: Ргерагасгоп о)~сР)гуА Е!Ьгапег аиг) Сеие Ег)епгг!гсаг!оп МЕТНО0 Ро1151с1щ о!' йе с0МА Теггп1п! 1. Неас йе сРХА !5сер 11, р. 1150) со 68'С гог 5 пиписея ТЫа асер г)епасигеа апу с)оиЫе-асгапс)ес) асгиссигеь йас гиау Ьаче уогтег) угот ргосгис!!п8 яп81еаггапдес) Сегпип! оу йе сРХА псо!еси1ея 2. Соо! йе сР)ч)А Со 37'С апс) асЫ СЬе го!1оччсп8 Со йе СиЬе: 5х Ьассег!орЬа8е Т4 РХА ро!утегаае герасг Ьийег 10 и! 5 гпм с)ХТР т!тгоо 5Ф НО Со 50 р! 3. АгЫ 1-2 ишга ог ЪасгепорЬа8е Т4 РХА ро1утегаве (500 ишгайп!) апг! шсиЬаСе йе геасНоп Гог 15 пиписеа ас 37'С. 4.
5сор йе геасс!оп Ьу асЫ)п8 1 )с! ос'0.5 Ьс ЕРТА (рН 8.0). 5. Ехсгасс йе аашр1е чч)сЬ рЬепоЬсЫогогопп, апс) гешоче сЬе ип!псогрогасес) с)ХТРа Ьу арипсо!шпп сЬготаго8гарЬу йгои8Ь 5ерЬас!ех С-50 (р!еаае аее Аррепйх 8). 6. АгЫ 0.1 чо1шпе ог 3 м аос))иш асесасе (рН 5.2) апс) 2 чо!итеь ог" есЬапо! со йе со1шпп 1)осч-СЬгои8Ь. 5!иге СЬе аатр1е гог аС !еааг 15 т)пигеа аС 4 С. 7. Кесочег йе ргес!р)гагес) сРХА Ъу сепгпги8агюп аг гпахппшп ареес) 1ог 15 т)пигеа аС 4 С !и а ш!сгоуи8е.
Ргу йе ре!1ес !и сЬе а!г, апс) сЬеп 6!аао!че )с !п 13 р! ос 10 шЬс Тпа-С1 (рН 7.6). Одам!оп о1 Е1п1сег-Адар1огь Ео йе с0МА 8. АсЫ сЬе го!!очч)п8 со йе гера!гес) РХАс ! Ох Т4 РХА !!8аае Ьиггег 800 — 1000 п8 оу рЬоарЬогу1асег) 1!п)сеча ог ас)аргоса 10' гуе!аа ип!саг'т! Ьассег!орЬа8е Т4 РХА 1!8аае !О псм АТР 2 Н! 2 и1 1 и! гр) М!х апс) !псиЪасе !ог 8 — 12 Ьоша ас 16 С.
1с ы еыепиа! со ые а чаас гпо1аг ехсеаа опсп1сега (>1004о!4) со епг иге сЬас сЬе еос)а оу йе сРХА Ьесоте !!8асес) со а 1!п)сег апс) иос со еасЬ осЬег. 9. ггг)сЬс)гаси 05 )с! ггогп сЬе геассюп апс) поге сЬе а1и!иос ас 4'С. !пасс)часе сЬе !18аае ш йе геша!пс)ег ог йе геасс!оп Ьу Ьеапп8 гог 15 ппписеа ас 68'С. Брес1а1 Ес)п! ргпеп1 5ерЬас)ех С-50 хрип со!итп Аг)г) 5ерЬас)ех 650 !тег)!ит роге) со асег!!е Н О ! 10 8 оу с)гу росчг)ег усеИа 160 пс! оу йсггу). 'чуааЬ йе ачго!1еп геяп часЬ асеп!е Н О сеялка! с!теа со геточе го1иЪ!е с)ехсгап, гчЬкЬ сап сгеасе ргоЫепса Ьу ргессрпаии8 с)иг!п8 есЬапо1 ргессрааиои. ртаИу, есСи!1!Ьгасе сЬе геяи сп ТЕ !рН 7.6), аисоааче !10 ря [0.70 )с8/стс! Еог 15 т!пи!ее), апс) аСоге аС гоогп Сегпрегагиге.
Ргерас)сег) со!игом оУ 5ерЬас1ех апг) осЬег 8е! 61сгаиоп геа!па аге сопипегс!а!1у ачас1аЫе. Сагагег ЬаСЬх ргеье! Го 76'С апс! 66оС Ршгосо! 1: 5гаеег 4: Апасатепг оу ст)гегг осАг!аргогг 11.55 Епдопссс!еа5е Офеь6оп оЕ ЕЬе Бп1сег-АдарЕог5 1Е епг)опис1еаае с)1цеас)оп Ы песегаагу со реппп 11еассоп оЕ йе сРХА со йе чессог, йеп ргосеед чч)сЬ Егерь 10 — ! 2 Ночгечег, ччЬеп иапо сегса)п ас)арсог шо1еси1ея епг)опис1еаае Йцеас)оп 14 пос гег)и)гес).!п сЬеае савей аЫр со 5сер 13.
Еог агЫпюпа1 с1есас1я р1еаае аее йе спсгог1иссюп со йса ргососо1. СЧсеп ия!пц Ьегп!рЬоарЬосу!агег) аг)аргоса (р!еаье атее йе !пггог)исг!оп Со йь ргогосо!), ап агЫ!С!опа! рЬоаРЬогу!ааоп асер еасЬ Ьасгег!орЬаие Т4 ро!упис!еосЫе Ыпахе гпиьс Ье сагпег) оис ассег !!еас!оп. РЬоарЬогу!ааоп ь еая!у сагпег! оиг Ьу агЫ!пе 30-50 ип!Са о! ЬасгегюрЬаце Т4 ро!упис1еоаг!е Ыпаче г)!гесГ1у Со йе Ьеаг-Сгеагег) !!Еаг!оп ргог)исгя а.
АгЫ Со йе Ьеагег) !брахе геас0оп: 10х Ьассег!орЬаее Т4 ро!упис!еосЫе Ыпаье Ьиссег 30! ЬасгепорЬаие Т4 ро!упис!еоСЫе Ыпаче 30 — 50 ип!15 Со 30 и! Ь. спсиЬасе сЬе геас0оп Еог 1 Ьоиг аг 37чС. с. Ргосеег1 г)!гесГ!у Со 5гер 13. 10. То сЬе Ьеасес! 118аае геаспоп, аИ: ! Ох ген!пес!оп епгуте Ьиууег Н,О геьггк6оп епгугпе 20 и! !50 и! 200 ип!сч Мсх йе геадепсь ас 0'С.
Аз а сопсгос, сгапгуст 2 и! оЕ сЬе геаспоп со а 0.5-гп1 т!сгоуихе юЬе. То сЬе 2-Сг! а1!4 лос, агЫ 100 п3 Лп а чо!игпе оЕ по пюге йап 0 5 и1) оЕ сопСго! РХА, Ее., еЬЬег а !!пеапгей р!аяпЫ ог а ргерага6оп оЕ аеачеи Ьассег!орЬаце Х РХА сЬас сопса!пз ап гпсегпа! ясе Еог сЬе рагски1аг гечсг!ссюп епгупк ичегС. 11. 1псиЪасе сЬе !агре-ьса1е геассюп апс! йе сопсго! геас6оп Еог 2 Ьоига ас 37чС. 12. Апа1ухе 1Ье ТГХА ш йе сопСго1 аашр!е апс1 йе 0.5-р1 а!и)иог чч)СЬ<)гаччп аС 5Сер 9 Ьу е!ессгорЬогеяа сЬгощЬ а 150 аеагоье ие!.
Еоаг) опе ог сччо!апеа оЕ сЬе 5е! илсЬ р1аяпЫ ог ЬасСег)орЬаие А гпаг)сег ТГХА. !Е йе !!цасюп Ьач ччогСгегС чче11, йе !!да!ей !й!гегч чЬои!й Ье ияЫе ач а япеаг ас йе Ьоссопс оЕ йе це!. !Е гС!аеас!оп чч!сЬ сЬе гечспс6оп епгугпе и сопгр!есе, сЬе япеаг оЕ !!пСгегч ьЬои!3 3!чарреаг апг) сЬе р!аяпЫ ог ЬассепорЬаце Х РХА !и йе сопсго1 гагар!е чЬои!д Ье с!еачегС арргорпасе!у, ТЬе яге оЕ йе сРХА ччс!1 пос сЬапхе арргес!аЫу асгег 1пхасюп со адар!оси Апа!уяч оЕ йе РХА Ьу це! е!ессгорЬогеч!г сап сЬегеуоге Ье огп!ссегС ччЬеп ияпц агСарсогя РгерагаЕ1оп оЕ Фе сЕИЧА Еог а!хе ГгасИопаЕ1оп 13. РипЕу сЬе с)3)ч!А Ъу ехсгассюп ччссЬ рЬепоЬсЫогоЕопп апг) всапдагг) ргессрпапоп ччЬЬ ейапоЬ Ыъььо)че йе с13!ч)А ш 20 р1 оЕ ТЕ (рН 8.0). 14. АсЫ 2.5 р1 оЕ а гю106оп оЕ 0.2550 ЬгошорЬепо! Ыие ш 5096 ц!усего1.
ТЬ)а агЫспоп яшр!с6еь йе пехс а!аде ш йе с13!ч!А 1сЪгагу — яхе-Егассюпасюп оЕ йе сЕ3)ч!А Ьу сЬгошасоагарЬу сЬгои5Ь 5ерЬагоае СЕ-4В (5!аде 5). 11.56 СЬаргег ) )г Ргерагаггоп огсРХА ЙЪгаггег апг) Сене Тг)еиггугсаггои СТАСЕ 5: Ггас6опа6оп о1 сЕНЧА Ьу Се! Гйга11оп 1Ьгоиф Берпагоье СЕ-4В Веуоге 1паегпоп !иго а ЬассепорЬаие )ъ ог р1аяиЫ чесгог (5гаВе 6), йе ргерагагюп оу сР)ъ)А )а Егас6опагег1 Ьу Ве1 671сгагюп го гепюъе ипиаес) 11п1сег-аг1арсога апг! 1оъч-то!еси1аг-ъче)ВЬ1 ргог1- исга сгеагег) Ъу геагпсгюп епкуте г)18еаг)оп оу ро1угпепкег! 11п)гегя Кегпоч)па Вогаагп !псгеааеа йе пшпЬег оЕ гесотЪ|папга 1Ьаг сопгагп сР)ъ)Аа апг) г1гапга6саБу гег)исеа гЬе пшпЬег оГ Еа1зе гесотЪ!пап!а йаг сопъагп пой!пц тоге 1Ьап аппеа1ег1 1гп)гегя Ргаспопа6пВ 1Ье сР)ъ)А аЬо сгеагеа ап орроггитгу го йасагг) сР!ъ)Аа йаг аге <500 Ьр ги 1еп816.
ТЬеае аЬогг баВтепь аге 1Ье ипъчапгег) ргог)исга оу 1псотр)есе аупгЬеяа оу Вггаг- апг1/ог аесопг)-а!ганг) сР)ь)А аунда)з апг) аге оЕ !гп1е иае со тоаг шчеьЬВагогя Е!игипаппц гЬеае 6аВтепга Ггот 1Ье 11Ъгагу сеггаш!у гег)исеа йе пшпЪег оЕ гесогпЪшапо йаг тиаг Ъе асгеепег) апг1 тау а!ао 1псгеаае йе сЬапсе гЬаг еп6ге аег)иепсеа оу 1Ье тК)ъ)Аа оГ шгегеЯ ъчг!1 Ъе гергеаепгег) )и йе 1!Ьгагу.
1п аоте сггсипьгапсея ГЬеге !а ап агЬ апгаВе ги еагаЫ)аЬ)пВ Гъчо 11Ьгапеа Егот йе 6.асгюпагег) ргерагагюп сР!ъ)А — опе сопса)и!пи сР)ъ)Аа ъчЬоае а)хеа гапВе 1а 6от 0.5 1сЪ го 35 1сЬ, апг) апогЬег синга)и)пц 1агиег сР)ъ)Аа. Весаиае оп1у а япа11 6аспоп оЕ 1Ье опи)па! тК!ъ)А рори1агюп 1а 1опиег 1Ьап 35 )гЪ, йе пшиЬег оЕ с!опек ш йе аесопг) !гЪгагу !а Вепега11у -10ого оЕ 1Ье пшпЬег гп 1Ье Вгаг. Ноччечег, еагаЫ)аЬ!пи апг) всгеепша а !гЬгагу еппсЬег) Еог!агВе сР)ъ)Аа !псгеааеа 1Ье сЬапсе апг) г)есгеазеа йе 1аЬог оЕ !ао1аг!пц Еи11-1епВ16 сР)ъ)Аа соггеаропйпц го гаге тК)ъ)Аа епсосппц 1агВе ргогешя Е!есггорЬогеяа 1ЬгоииЬ ацагоае ог ро1уасгу1атЫе ие1з гпау а!ао Ье иаег) го аерагасе ип118агег) 1!п)гег-ас)арсога !гоги сР!ъ)А апг1 го бас!!опаге йе сР!ъ)А Ьу иге.
Ноъчечег, йе гесочегу оЕ сРЫА 6от це1а гп а Еопп йаг сап Ъе 1!да!ее) еубс!епг1у го йе чесгог сап Ье роог, апг) сЬгогпагоагарЬу 1ЬгоииЬ а 1опВ паггоъч со!игпи !27 х 0.3 сгп) оЕ 5ерЬагоае СЬ-4В )а йегеуоге йе Ьея ор6оп. МАТЕВ1АсБ Войегь апд йо1ойопб Р1еаае атее Аррепг))х 7 Еог сотропеп1а оЕ ь1ос)г ао!и11опа, Ьнууега, апг1 геадеп1я 01!иге 41ос)г ао1ноопа 1о 1Ье арргорпа1е соисеиггаоопя Ейапо) Бос))ит асегаге 13 М, рН 5.2) ТЕ <рН 7.6) ТЕ 7рН 7.6) сои)а)тп8 0.7 м ХаО Тг)ь-С1 17 М, рН 8.0) Се!8 Адагоае Ве) 17% Р1еаае аее 5гер о. Ь)ыс1е1с Ас14Ь апд О1фопос!ео6деь СОХА )Ле гЬе е))е)А ргерагег) ш 5гаае 4, 5герв 13 аог) 14.
Маг)гег РХА ТЬе огаг1гег 1)14А аЬоо1о Ье еог)-!аЬе!ег) Егаагпепга гап81п8 го яае оогп 200 Ьр го 5 )гЬ. Русого! 1: 5га5е 5| Е гаг6опа6оп о) гРИА Ьу бе! р!!!гас!оп гЬгоиеЬ 5ерЬагоге СЕ-4В !1.57 прес!а! Ес!сс!рпъес)$ Игегег! еогпргеяег! аи НетоЯаС ог ег)и!ча!епг Ьоае е!атр Нурог!егт!с пеег!!е ъч!СЬ а Ьеп| Ьр Р|репе, е!!ароааЫе 1! тВ Ро!уч!пу! 0Ыопде сиЬ!пе 50|55ОГ5 5ерЬагоае СЕ-4В ЪЧа|Ь йе раич ъиррс)еь) Ъу сЬе шаписасшгег аечега! Во|еа ш пег))е ТВ !РН 7.6) сои!а)псо5 О.
| м )ъ)аС!. ТЬЬ ъча|ЫпВ гепюче| |оЬ~Ь~согь о!!)Вас)оп ргеъепс |и ъоше ЬассЬеь ос сЬе Ве!. Ргерас)се|С со!ишак ос 5ерЬагоке С!.-4В С5)ке5ер 400 5роп Со!игппь) аге а|а|!аЫе !гош АшегзЬаш РЬагшасса ВсосесЬ. |4пу! ЬиЬЫе СиЬ!па ИгЬагтап ЗММ рарег МЕТНО0 Ргерага6оп о1 берЬаго5е С!.-4В Со!шпп 1. ЕЛе а Ьурос)егш!с пеес)!е чбй а Ъепс епс) со ри1! йе сопоп ъчоо! р1ефес Ьа16чау оис оГ сЬе епс! оуа а|егбе, йароааЫе 1-ш1 р|реие. СиС йе р1ег)Вег ш Ьа1ГъчЬЬ Яеп1е ас!хаоса. Р)аеас|! йе 1ооае р!есе оГ соссоп ъчоо!.
С)ае 61сеге|! сошргеяе|! а|г со Ыоъч йе гешашг!ег ос йе р1е|1- цес со |Ье паггоъч епс) ос |Ье р|рессе. 2. АиасЬ а р!есе оу асеп!е ро1уч!пу! сЫо66е сиЬ!па (оГ сЬе суре погша11у иаес) |и рег!а!а!с!с ригпра) со |Ье паггоъч епг) оу |Ье р|реие. Р|р |Ье ъч!с)е еп|1 оу |Ье р|реие |псо а ао106оп оу ТЕ !рН 7.6) гипса!и!пВ О. ! м )ъ)аС! ш а Ьеа1|ег. АссасЬ сЬе сиЬ!пВ со ап Ег!епшеуег Ваа)с соппессес) со а часишп Впе. Арр1у Веп|1е |шсиоп ипс!1 йе р!рессе |а 61!ед ъч!|Ь Ьибег. С!оае йе сиЬ!па ъч!|Ь а Ьешоасас.
3. АиасЬ а р|есе оу ч!пу! ЪиЬЫе сиЪ)пВ со йе ъч!г)е епъ) оу йе р!рессе. И! сЬе ЬиЬЫе СиЬ!па ъчпй 5ерЬагоае С1.-4В ес)ш1!Ъгасес) ъч!сЬ ТЕ (рН 7.6) сои!а!и!пц О. ! м ЫаС1. А!1оъч йе а1иггу со аесс1е Гог а Геъч пипшеа апс) сЬеп ге1еаае йе Ьетояас. ТЬе со!шпп ъч!11 Гост аа йе Ьийег с)г!ра 6от СЬе р|реие. 1Г песеяагу, а|Ы гпоге 5ерЬагоае С1.-4В ип61 СЬе рас)сес) таспх а1тоя 6)14 йе р|реие. ТЬе гВ|пепяоп| ос йе рас)ъес) со!шпп ьЬоисй Ье -27 х 0.3 сгп.
4. ЧгааЬ йе со!шпп ъч!|Ь аечега! со1шпп чо1шпеа ос ТЕ !рН 7.6) сои!а!п)па 0.1 М )ъ)аС1. Айег ъчааЬспВ |а еогпр1есе|1, иае а Ьегпоасас со с1оае |Ье сиЬ!пВ ас йе Ьоиот ог" йе со!шпп. берагайоп агъс! Кесоъгегу о1 6!ке-Ве!естес! СОМА 5. Рае а раяеиг р!репе со гешоче сЬе Вшс! аЬоче |Ье 5ерЬагоае С1.-4В. Арр1у сЬе сРХА (!и а чо1шпе оГ 50 р! ог!ея) со |Ье со1шпп. Ке1еаае йе Ьешоасас апс) а!!оъч сЬе сР)ь)А со епсег йе Ве! |паСПх. ъ'ъгааЬ йе ппсгоуиае СиЪе овес) Со аСоге йе сРХА ъч!СЬ 50 р! оГ ТЕ (рН 7.6), ап|1 арр!у йь со йе со!шпп. Р!П |Ье ЪиЪЫе сиЬ!па ъч)сЬ ТЕ 1рН 7.6) сои!а!и!пВ О.! м ХаС!. А !)ЧСРОКТАЫТ Ро по| аПоъч СЬе со!итп Со гип г!гу а| апу агаае! 6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
